双功能过氧化氢酶催化氧化环化反应

氧化环化反应是天然产物生物合成和化学合成中构建分子骨架的重要手段。化学合成中环化成键一般涉及手性控制、效率低、环境污染等问题,而酶能在比较温和的条件下立体选择性的催化成键反应,因此高效催化成键成环反应的酶展示出巨大应用潜力,引起了化学家的广泛兴趣。这些酶包括天然产物生物合成过程中的高效特异性催化C-C键形成的各种环化酶。近日,中国科学院微生物研究所高书山研究组在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中鉴定了一个全新类型的双功能过氧化氢酶EasC,该酶不仅可以分解过氧化氢形成水和氧气,更令人惊讶的是,该酶利用氧气作为氧化剂,通过氧化脱羧构建新的C-C键成环,达到合成麦角生物碱类药物的药效团ergoline中间C环的目的(图1)。图1 麦角生物碱药效团ergoline中间C环生物合成EasC来源于烟曲霉麦角生物碱的生物合成基因簇,它与过氧化氢酶中的小亚基家族(SSC)高度同源,含有与SSC类似的heme和NADPH结合位点。研究者在大肠杆菌中纯化得到了可溶性的EasC蛋白,并在体外证明了该酶可以高效催化过氧化氢分解生成氧气(图2a)。这些生物信息学证据与生化证据都证明了EasC是一个过氧化氢酶。但是研究者进一步的同源蛋白序列比对发现,相较于传统的过氧化氢酶,EasC又具有多个不同的保守氨基酸位点;进一步的进化树分析发现,EasC蛋白处于一个全新的、未表征的独立分支(图2b)。这些生物信息分析结果都指向该酶与普通的过氧化氢酶具有不同的功能。由于麦角生物碱生物合成基因簇中其他酶都已经被证实没有参与C环的生物合成,因此研究者推理EasC除了具有过氧化氢酶活性之外,还能通过催化形成新的C-C键来合成C环。体外生化实验证实了研究者的推论,该酶在空气中能将化合物1高效转变为化合物2,高效特异性催化手性C5-C10单键的形成(图3)。然后研究者利用各种生化反应手段,包括反应体系添加或不添加过氧化氢、无氧催化、有氧催化、同位素标记(18O2和H218O)等,在体外发现EasC蛋白是利用氧气作为氧化剂,而不是过氧化氢,生成酶活性中间体Compound I;Compound I引发了接下来的一系列反应,包括氧化脱酸、C5-C10关环以及最后的羟基化反应(图3)。加州大学洛杉矶分校的Prof. K. N. Houk课题组利用密度泛函理论计算证明了该反应机制的合理性,例如关键的C5-C10键形成(图3: 化合物4→6)是一个低能过渡态反应(ΔG‡ = 6.1 kcal/mol)。这是首例过氧化酶参与的、利用氧气作为氧化剂,催化新的C-C成键与氧化成环反应。图2 EasC过氧化氢酶活性和蛋白聚类分析图3 推测EasC的催化机理本篇文章报道的过氧化氢酶代表了一种全新类型的生物催化剂,证明了自然界可以将普通的过氧化氢酶进化成可以催化复杂C-C成键与氧化环化反应的单加氧酶。本项目解决了该类药物研究中半个多世纪以来悬而未决的难题,丰富了催化C-C成键与氧化环化反应的生物催化剂类型,证明了过氧化氢酶具有广泛生物催化开发前景。该研究成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.,助理研究员姚永鹏博士和博士后安春艳博士为论文共同第一作者。该工作受到科技部重点研发计划、中科院先导专项、自然科学基金委面上和青年项目以及中国科学院青年促进会会员项目的经费支持。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Catalase Involved in Oxidative Cyclization of the Tetracyclic Ergoline of Fungal Ergot AlkaloidsYongpeng Yao, Chunyan An, Declan Evans, Weiwei Liu, Wei Wang, Guangzheng Wei, Ning Ding, K. N. Houk*, Shu-Shan Gao*J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 17517-17521, DOI: 10.1021/jacs.9b10217高书山博士简介高书山,中国科学院微生物研究所研究员,博士毕业于中国科学院海洋研究所,毕业后先后在英国布里斯托大学化学系从事研究助理,在加州大学洛杉矶分校化学与生物分子工程系Yi Tang组从事博士后研究。曾获中国科学院院长优秀奖(2011年)。2018年全职引进至中国科学院微生物研究所。高书山课题组主要研究领域为真菌天然产物生物合成、临床化学药物分子的酶工程化、生物合成酶的合成生物学研究,在Journal of the American Chemical Society, Angewandte Chemie International Edition(封面文章2017), Natural Product Reports, Organic Letters, Journal of Natural Products等著名期刊上发表近30篇SCI文章,多篇研究被选为NPR亮点,申请国家发明专利6项。

来源: X-MOL 2019-11-09

Angew. Chem.:蛋白-蛋白以及蛋白-核酸大分子复合体的光控化学交联

小分子化学交联剂结合现代化的交联质谱技术是一种新兴的研究蛋白-蛋白以及蛋白-核酸大分子复合体的有力手段。目前常用的小分子交联剂主要与目标蛋白Lys氨基酸残基反应,并且不具有时空分辨率。发展小分子交联剂能够特异性与多个氨基酸残基进行交联并具有时空分辨率能够极大促进蛋白质相互作用的研究。近日,加州大学旧金山分校王磊教授(点击查看介绍)团队合成了一系列带有光保护的醌甲基化物(QM)小分子化学交联剂。使用这些交联剂,可以通过远紫外光(365 nm)诱导从而特异性的释放活化的醌甲基化物进行蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸之间的交联。这种策略不仅能够使得蛋白交联获得时间分辨率,引入的强活性的醌甲基化物可与许多邻近的亲核性的残基,如 His、Lys、Tyr 等侧链反应而产生蛋白交联。并且这些交联剂不仅使适用单个蛋白的交联,也可以在细胞裂解液以及在活体细胞中诱导蛋白-蛋白发生化学交联。作者首先合成一端带有醌甲基化物前体,另一端带有NHS酯基的小分子化学交联剂(NHQM)。通过对14-3-3 目标蛋白紫外光照射与否以及加不加NHQM交联剂处理,作者发现只有在加入NHQM交联剂并且紫外光照射下才会诱导产生14-3-3二聚体。并且这种二聚体的产生可以很好的通过光控实时的产生。作者进一步证明了NHQM交联剂的其中一个实用性-可以快速鉴别蛋白聚合情况,并且利用化学交联质谱鉴别了在14-3-3蛋白上与醌甲基化物反应的亲和性残基。与文献报道的醌甲基化物的强活性一致,NHQM 可以与大多数亲和性残基发生反应,包括之前没有报道过的Gln、Arg、Asn弱的亲核基团发生交联。接着,作者测试了NHQM在活体细胞内的交联情况,发现细胞体内交联效率较弱,这可能与短时间内NHQM穿膜性和溶解性差有关,而增长穿膜时间NHS会快速水解从而使交联失效。为了解决这一问题,作者合成了两端都带有光保护基团的醌甲基化物前体(HoQM)并并证明它可以用于细菌细胞以及哺乳动物细胞内诱导蛋白分子间交联,并且具有时间选择性。除了用于蛋白-蛋白交联,醌甲基化物可以修饰核酸,最后作者证明了NHQM交联剂也可以通过光控诱导蛋白-核酸交联。相关论文发表于Angew. Chem. Int. Ed.。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Photocaged Quinone Methide Cross-linkers for Light-controlled Chemical Cross-linking of Protein-protein and Protein-DNA ComplexesJun Liu, Lingchao Cai, Wei Sun, Rujin Cheng, Nanxi Wang, Ling Jin, sharon rozovsky, Ian Seiple, Lei WangAngew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201910135导师介绍王磊https://www.x-mol.com/university/faculty/78612 https://pharm.ucsf.edu/wang/research(本稿件来自Wiley)

来源: X-MOL 2019-11-07

人工驯饲提升非耐寒生命活体抗冻性研究

目前,低温冷冻保存是生物材料长期保存的唯一可行途径,然而最先进的冷冻保存技术对稍显复杂的细胞尚难以实现较高复活率,更无法成功实现组织器官和复杂生命个体的低温保存。在临床医学的应用上,组织和器官长期冷冻保存技术的缺失为再生医学的发展带来巨大的限制。临床上目前多采用短期低温保存或延时保存技术(4 °C左右)用于器官移植,但器官的冷缺血耐受时间较短,典型的譬如:心肺4小时,肝、肠、胰腺8~12小时,肾最长,为36小时,但其功能细胞肾小球耐受时间只有不到24小时。由此导致目前临床超过70%的心脏因为评估和匹配的所需的时间超过了保存限制而被废弃。针对这样的现状,寻求器官长期有效的冷冻保存方法是最有效的解决方案,但这一直都是冷冻保存技术的“阿喀琉斯之踵”。为了寻找理想的低温保存方法,中国科学院理化技术研究所低温工程学重点实验室低温生物与医学课题组从自然界的耐寒生物中寻找灵感,学习耐寒生物的耐寒机制及应对低温损伤的策略,调节生物应对低温及冷冻伤害时的代谢活动,探究器官冷冻保存的可行之路。自然界中有许多耐寒生物(例如某些昆虫和两栖类动物)能够通过合成及积累冷冻保护剂、保护性脱水等措施来抵抗冬季寒冷的刺激。受这些抗冻机制的启发,在饶伟研究员的主导下,研究小组通过低温驯化及喂饲低温保护剂L-脯氨酸,成功将冷冻敏感型日本弓背蚁(Camponotus japonicus Mayr)转化为冷冻耐受型(图1)。该研究成果发表在Science Bulletin。其中,中国科学院理化技术研究所研究生窦蒙家及联合培养生李亚洲为本文共同第一作者,李雷副研究员和饶伟研究员为文章的共同通讯作者。图1. L-脯氨酸训饲使冷冻敏感型蚂蚁转化为冷冻耐受型生物体。图片来源:低温生物与医学课题组文章首先详细探讨了冷冻时间、降温速率、冷却最低温度、复温温度等因素对蚂蚁存活率的影响,并提出了最优化的冻存方案。在此基础上,对 L-脯氨酸喂饲及低温驯化后的蚂蚁进行冷冻-复温实验。使蚂蚁在−27.66 °C下的冻存活率从37.50%(自然状态下的冻存活率)提高到了83.89%(图2),而且冻存复温后的蚂蚁依旧能保持正常的形态,并拥有肢体活动及进食的能力。图2. 日本弓背蚁耐寒性提升。(a)蚂蚁体液凝固点随L-脯氨酸的积累而降低;(b)不同浓度L-脯氨酸训饲的蚂蚁经历-27.66 °C低温后的存活率;(c)自然界采集的蚂蚁的形态;(d)蚂蚁冷冻后的形态。图片来源:低温生物与医学课题组同时,利用低温显微镜控温及红外影像分析,可视化地展现了降温及升温过程中蚂蚁体内温度的变化及分布(图3)。研究结果表明,L-脯氨酸在蚂蚁体内的积累使得蚂蚁在降温过程具备较低的降温速率,而在升温过程升温速率较快(图3)。最为重要的是,L-脯氨酸的积累有助于减轻蚂蚁脑部的结冰过程,大大保护了中枢神经系统在低温下的损伤,对提升蚂蚁的抗冻能力至关重要。图3. 蚂蚁在降温和复温过程中体温的变化及不同部位的温度分布。(a) 2 °C min-1降温速率下的蚂蚁红外热成像;(b) 2 °C min-1升温速率下的蚂蚁红外热成像;(c)喂食Pro-0和Pro-30日粮的蚂蚁在降温和升温过程中的平均体温;(d)喂饲Pro-0的蚂蚁体内不同部位的平均温度;(e) 喂饲Pro-30的蚂蚁体内不同部位的平均温度。图片来源:低温生物与医学课题组为了进一步明确L-脯氨酸驯饲对蚂蚁存活的生理学机制,研究人员对蚂蚁体内的氨基酸含量进行了代谢组学分析,并且运用热力学方法对于含水量进行了定量检测(图4)。结果表明,喂饲富含L-脯氨酸的饲料使蚂蚁体内的L-脯氨酸含量从1.78 ng g−1积累到 4.64 ng g−1,并且其他氨基酸(例如丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等)的含量也有所增加。差式扫描量热仪(DSC)等分析证明,驯饲后的蚂蚁体内水含量,特别是自由水的比例降低,这有助于蚂蚁体液冰点的减低,减少低温损伤。这些发现表明,研究小组提出的人工驯饲策略,与自然界中生物通过积累抗冻物质(例如海藻糖、抗冻蛋白等)及脱水等来应对冬季寒冷挑战的耐寒机制一致。图4. L-脯氨酸训饲后的蚂蚁的生物物理学变化。(a)对不同浓度L-脯氨酸训饲后蚂蚁氨基酸代谢分析;(b)不同浓度L-脯氨酸训饲对蚂蚁体内L-脯氨酸浓度的影响;(c) Pro-0和Pro-30训饲的蚂蚁不同身体部位(头部、胸部和腹部)内L-脯氨酸的积累;(d)蚂蚁体内渗透活性水和非渗透活性水的比例。图片来源:低温生物与医学课题组此外,基因分析显示热激蛋白等基因表达提高,进一步阐释了蚂蚁应对寒冷刺激的生物学作用机制(图5);同时检测发现大部分上调的基因位于核糖体中,而核糖体正是L-脯氨酸代谢的主要细胞器。图5. L-脯氨酸驯饲后蚂蚁的基因表达变化。(a)差异表达基因火山图;(b) L-脯氨酸驯饲后的代表性上调基因的热图谱;(c) 训饲蚂蚁前后的差异基因基于日本京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析;(d) 训饲蚂蚁前后的差异基因基于基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集分析的生物过程有向无环图。图片来源:低温生物与医学课题组这项研究通过热力学条件优化筛选与L-脯氨酸驯饲成功地提升了非耐寒性日本弓背蚁的耐寒能力(图6),L-脯氨酸驯饲后的蚂蚁在-27.66 °C冷冻的存活率相比较对照组增加了两倍多。热力学及代谢组学分析揭示出L-脯氨酸在蚂蚁体内的积累,蚂蚁体内活化水含量降低等因素均有助于减少冷冻损伤。更为重要的是,本研究首次阐明了外源性冷冻保护剂在蚂蚁体内的积累对于蚂蚁的基因调控与耐寒性提升之间关系的影响。冷敏感蚂蚁相变过程中抗损伤机制的研究将为今后组织器官保存和复杂生物体的低温保存相关研究提供理论和技术支持。图6. L-脯氨酸训饲后蚂蚁的抗冻能力提升机制。图片来源:低温生物与医学课题组原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):L-proline feeding for augmented freeze tolerance of Camponotus japonicus MayrMengjia Dou, Yazhou Li, Ziqiao Sun, Lei Li, Wei RaoSci. Bull., 2019, DOI: 10.1016/j.scib.2019.09.028导师介绍李雷中国科学院物理化学技术研究所副研究员。2003年获清华大学热能工程系学士学位,2009年获清华大学医学院生物医学工程系博士学位。2015年至2016年哈佛大学医学院麻省总医院访问学者。主要从事微流控芯片相关研究,近期关注于微组织工程技术、生物保存和微流体平台的交叉研究工作。饶伟中国科学院物理化学技术研究所研究员。2003年与2006年分别获得哈尔滨工业大学学士及硕士学位,2009年获中国科学院物理化学技术研究所低温与制冷工程博士学位。2010年至2015年分别在弗吉尼亚联邦大学及俄亥俄州立大学进行research scientist 及博士后研究。长期致力于低温生物学、微/纳米材料和常温液态金属等交叉学科,希望将前沿的微/纳米技术引入冷冻医学,以实现冷冻过程能质的精确调控。http://www.ipc.cas.cn/sourcedb_ipc_cas/cn/lhsrck/dwswyyxyjz/201607/t20160714_5262415.html

来源: X-MOL 2019-10-24

以毒攻毒?寄生虫感染或能影响HIV感染

武侠小说的主角们中毒时常常会用上一种凶险却又神奇的解毒方法——以毒攻毒。利用物性上的相克关系,拿一种毒物去抵抗另一种毒物的侵染,听上去就很酷。不过这种奇妙的对抗关系往往可遇而不可求。对人类来说,威胁生命的毒物太多了,除了常规的毒药外,寄生虫、细菌、病毒等微生物感染也可以算在内。但一般情况下它们在威胁人命这件事上都是“互相帮助”的。不过,最近英国和荷兰的研究人员发现某些寄生虫感染竟然能够降低免疫细胞对HIV-1病毒的易感性,颇有“以毒攻毒”的感觉。曼氏血吸虫(左)和虫卵(右)的显微照片。图片来源:Wikipedia、MSU故事要从曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)这种寄生虫说起。顾名思义,寄生虫就是要靠寄居在宿主体内繁殖、发育,曼氏血吸虫主要寄生在人类的肠道,病变位置则以结肠、肝脏等器官为主。不过人类也不是毫无反手之力,强大的免疫系统能够识别并清除包括寄生虫在内的许多外来异物。曼氏血吸虫为了顺利寄生在人体内,开发出了许多免疫逃逸的策略。其中就包括调节CD4+ T淋巴细胞的功能。同时,我们知道CD4+ T淋巴细胞还是HIV-1进入人体后的主要感染目标。因此,科学家就想,曼氏血吸虫感染是否会通过改变CD4+ T淋巴细胞而影响到HIV-1感染呢?曼氏血吸虫的生命周期。水域和蜗牛是该寄生虫重要的传播媒介。图片来源:Wikipedia当然,曼氏血吸虫是一种比较复杂的生物,整体研究起来比较麻烦。好在经过一些前期的研究,研究者把目光聚焦在了曼氏血吸虫卵中提取的可溶性卵抗原(SEA)。HIV-1感染CD4+ T淋巴细胞有两种主要途径:反式感染(trans-infection)和顺式感染(cis-infection)。这两种感染方式在流行病学统计中势均力敌,都是主要的感染方式。顺式感染中,HIV-1直接通过CD4分子和相关受体感染T细胞;而反式感染中,HIV-1先被树突细胞(DC)捕获,再传递给CD4+ T细胞。研究人员发现,曼氏血吸虫卵的SEA能够抑制HIV-1的反式感染,却不能抑制顺式感染。原因在于,SEA能够阻止树突细胞的“捕手”DC-SIGN蛋白与HIV-1的结合。SEA抑制DC-SIGN与HIV-1结合(上);上清液中p24含量说明SEA抑制DC-CD4+ T淋巴细胞共培养体系中HIV-1水平(下)。图片来源:PLoS Pathog.当CD4+ T淋巴细胞识别到不同感染源,会被诱导成不同的效应细胞(Th细胞)。通常来说,Th1细胞由病毒感染诱导,Th2细胞由寄生虫感染诱导,Th17细胞由细菌和真菌感染诱导。那么寄生虫是否会影响CD4+ T淋巴细胞的诱导产物呢?为此,研究人员建立一套体外培养体系。他们将寄生虫与未成熟的DC细胞(iDC细胞)共培养,通过LPS等刺激物使DC成熟,并与CD4+ T淋巴细胞相互作用,产生不同类型的Th细胞。最后将这些Th细胞与HIV-1一起培养,进行感染,以SF162+信号作为细胞感染了HIV-1的证据。结果表明,SEA能够明显降低Th2细胞对HIV-1的易感性,而对Th1细胞基本没有影响。Omega-1作为SEA的主要成分之一,同样能够抑制HIV-1感染,并可能影响疾病进程。体外寄生虫与细胞共培养实验示意图(A);Th细胞对HIV-1易感性测试(B、C)。图片来源:PLoS Pathog.此外,研究者还证明了SEA对CD4+ T淋巴细胞易感性的抑制与细胞因子表达水平、CCR5(HIV-1传播中的主要受体)表达水平均无关,而是独立地与细胞发生作用。这一研究有什么实际意义?从应用角度来说,抗HIV-1疫苗或药品的人体试验或许应避开曼氏血吸虫病蔓延的地区,以防止曼氏血吸虫病干扰试验结果。感染病虽然已伴随人类数百万年,仍有大量谜团蕴含其中,而感染病之间的相互作用和影响则更加错综复杂,想必也是未来人类攻克严重感染病的重要基础。或许用一种可控的感染治疗另一种难治感染是新的疗法,看似“以毒攻毒”的疗法蕴含着大自然最基本的自然法则。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Schistosoma mansoni soluble egg antigen (SEA) and recombinant Omega-1 modulate induced CD4+ T-lymphocyte responses and HIV-1 infection in vitroPLoS Pathog., 2019, DOI: 10.1371/journal.ppat.1007924(本文由氘氘斋供稿)

来源: X-MOL 2019-10-19

阐明细胞与氧气如何“互动”,三位科学家获2019年诺贝尔生理学或医学奖

2019年诺贝尔生理学或医学奖于10月7日揭晓,美国哈佛大学医学院教授William G. Kaelin Jr.、英国牛津大学教授Peter J. Ratcliffe爵士、美国约翰霍普金斯大学教授Gregg L. Semenza因为在“细胞如何感应和适应氧气供应”中的研究和发现而获奖。Gregg L. Semenza教授、Peter J. Ratcliffe爵士、William G. Kaelin Jr.教授William G. Kaelin Jr.教授于1957年出生于美国纽约。他在杜克大学获得医学博士学位,随后在约翰霍普金斯大学和达纳-法伯癌症研究所进行了内科和肿瘤学的训练。2002年,他成为哈佛医学院的正式教授。自1998年以来,他一直是霍华德·休斯医学研究所的研究人员。Peter J. Ratcliffe爵士于1945年出生于英国兰开夏郡。他毕业于剑桥大学,随后在牛津大学成立了自己的独立研究小组,并于1996年晋升为教授。Gregg L. Semenza教授于1956年出生于美国纽约。他在哈佛大学获得生物学学士学位,并于宾夕法尼亚大学获得博士学位(MD/PhD)。在约翰霍普金斯大学完成博士后训练之后留校任教,并于1999年晋升为教授。氧气的重要性不用多提,近期看过《攀登者》的读者应该都能有直观的感受。包括人类在内,地球上的动物都需要氧气才能生存。但氧气如何影响细胞的生命活动,细胞又如何适应氧气水平的变化,这些问题科学家们却一直没能研究的很清楚。这三位科学家的工作,正是揭示了这些重要过程的分子机制。这不仅为我们了解氧气水平如何影响细胞代谢和生理功能奠定了基础,也为抗击贫血、癌症和许多其他疾病的新策略铺平了道路。缺氧诱导因子HIF的发现促红细胞生成素(EPO)激素水平的升高是对低氧水平(缺氧)的关键生理响应,这会导致机体增加红血球的产生。这一现象在20世纪初就已为人所知,但是氧气水平的变化如何诱导这一现象发生仍然并不清楚。Gregg Semenza教授研究了EPO基因,以及氧气水平的变化如何调控这一基因。他们使用基因修饰小鼠进行实验,发现位于EPO基因旁边的特定DNA片段介导了对缺氧的响应。Peter Ratcliffe爵士也研究了EPO基因的氧气依赖性调控,两个研究小组都发现,几乎所有组织中都存在氧传感机制,而不仅只存在于通常产生EPO的肾细胞中。这些重要发现表明,该机制在许多不同的细胞类型中起作用,是一种通用机制。Gregg Semenza教授的进一步研究发现,一种蛋白质复合物能够以一种氧依赖的方式与上述DNA片段结合,他称这种复合物为缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)。1995年,Gregg Semenza教授发表了他的一些关键发现,包括鉴定编码HIF的基因。HIF由两种不同的DNA结合蛋白组成,即所谓的转录因子,现在称为HIF-1α和ARNT。缺氧条件下细胞响应的分子机制“意外”的VHL当氧气水平很高时,细胞中几乎没有HIF-1α,而当氧气水平低于正常值时,HIF-1α的水平会增加,可以结合并调节EPO基因以及其他具有HIF结合DNA片段的基因(图1)。这是因为,正常氧气水平下,一种被称为蛋白酶体的细胞机器(蛋白酶体的发现荣获了2004年诺贝尔化学奖)会迅速降解HIF-1α,而在缺氧情况下,HIF-1α的降解却被抑制。在蛋白酶体降解HIF-1α之前,一种小肽——泛素(ubiquitin)会作为“降解标签”加到HIF-1α蛋白上,不过,泛素如何以氧依赖的方式结合HIF-1α仍然是一个未解之谜。答案来自一个意想不到的方向。大约在Semenza和Ratcliffe探索EPO基因调控的同时,William G. Kaelin Jr.教授正在研究一种遗传综合征,即von Hippel-Lindau's disease(VHL病)。这种遗传疾病会导致具有遗传性VHL突变的家族罹患某些癌症的风险急剧增加。Kaelin教授发现VHL基因编码的一种蛋白质可防止癌症发作。意外的是,Kaelin教授还发现显示缺乏功能性VHL基因的癌细胞中会出现缺氧调节基因的异常高水平表达,而当VHL基因重新引入癌细胞后,这些基因表达恢复了正常水平。这些线索表明VHL以某种方式参与了对缺氧响应的调控。来自几个研究小组的其他线索表明,VHL是一个蛋白质复合物的一部分,该复合物用泛素标记蛋白质,加上“降解标签”的蛋白质随后在蛋白酶体中降解。Ratcliffe和他的研究小组随后做出了一项关键发现:证明VHL可以与HIF-1α相互作用,这对于正常氧水平下HIF-1α的降解是必需。这最终将VHL与HIF-1α联系起来,VHL这个“意外发现”也参与了细胞对于氧气水平变化的响应。细胞如何感应氧气水平变化?上述工作仍然不能完全细致地解释氧气水平如何调节VHL和HIF-1α之间的相互作用,也就是说,前面的工作揭示了细胞在氧气水平发生变化时如何做出正确响应,但细胞是如何“知道”氧气水平发生了变化的呢?Kaelin和Ratcliffe都猜测氧气感应的关键应该还与HIF-1α有关,答案可能就在蛋白结构域中的某个位置。2001年,在两篇同时发表的文章中他们报道,在正常的氧气水平下,HIF-1α的两个特定位置处会加上羟基(图1)。这种蛋白质修饰过程被称为脯氨酰羟化(prolyl hydroxylation),使得VHL能够识别并结合HIF-1α,从而解释了正常氧气水平如何通过氧敏感酶(即脯氨酰羟化酶prolyl hydroxylases)来控制HIF-1α的快速降解。Ratcliffe等人的进一步研究确定了相关的脯氨酰羟化酶。研究还表明,HIF-1α的基因激活功能也受到氧依赖羟基化作用的调节。这些发现揭示了细胞的氧气感应机制。细胞对氧气的感应和适应影响生理功能和病理过程氧气感应使得多种组织细胞能够调整新陈代谢以适应变化的氧气水平,例如剧烈运动中的肌肉组织。此外,新血管生成、红细胞产生、免疫系统响应以及许多其他生理功能也可以通过氧气感应机制进行微调。此外,氧气感应也与许多疾病有关。例如,患有慢性肾功能衰竭的患者通常由于EPO表达降低而患有严重的贫血。如上所述,EPO由肾脏中的细胞产生,对于控制红细胞的形成至关重要。此外,氧调节机制在癌症中具有重要作用。三位科学家的贡献不仅帮助我们了解氧气与细胞的“互动”,也为研发治疗贫血、癌症等多种疾病的治疗方案奠定了坚实基础。关键论文Semenza, G.L, Nejfelt, M.K., Chi, S.M. & Antonarakis, S.E. Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88, 5680-5684Wang, G.L., Jiang, B.-H., Rue, E.A. & Semenza, G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92, 5510-5514Maxwell, P.H., Wiesener, M.S., Chang, G.-W., Clifford, S.C., Vaux, E.C., Cockman, M.E., Wykoff, C.C., Pugh, C.W., Maher, E.R. & Ratcliffe, P.J. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature,  1999, 399, 271-275Mircea, I., Kondo, K., Yang, H., Kim, W., Valiando, J., Ohh, M., Salic, A., Asara, J.M., Lane, W.S. & Kaelin Jr., W.G. HIFa targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science, 2001, 292, 464-468Jakkola, P., Mole, D.R., Tian, Y.-M., Wilson, M.I., Gielbert, J., Gaskell, S.J., von Kriegsheim, A., Heberstreit, H.F., Mukherji, M., Schofield, C.J., Maxwell, P.H., Pugh, C.W. & Ratcliffe, P.J. Targeting of HIF-α to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 2001, 292, 468-472注:以上内容编译自诺贝尔奖官方网站,图片等内容版权归属于Nobelprize.orghttps://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2019/summary/往年诺贝尔生理学或医学奖回顾:2016年诺贝尔生理学或医学奖揭晓,大隅良典因发现自噬机理获奖2017年诺贝尔生理学或医学奖揭晓,发现控制“昼夜节律”分子机制的三位美国科学家获奖“肿瘤免疫治疗”获青睐,两位先驱获2018年诺贝尔生理学或医学奖

来源: X-MOL 2019-10-07

妈妈吃的太“油腻”,宝宝可能不太聪明?

对于女同胞们来说,怀孕和哺乳期间可能是唯一不需要考虑体重而放开享用美食的时候。多吃一点,吃好一点,反正一人吃两人用,一切都是为了宝宝的营养嘛。图片来源:电影《天下无贼》不过,最近的一项研究结果表明,妈妈如果在怀孕和哺乳的时候摄入太多脂肪,可能会适得其反。来自美国约翰霍普金斯大学医学院的Kellie Tamashiro教授团队,长期关注哺乳动物怀孕期间压力、饮食和免疫系统异常对后代神经系统、代谢等方面的影响。这一次他们的目光落在了高脂饮食对后代大脑发育的影响上。最近他们在研究中发现,雌性大鼠在孕期和哺乳期脂肪摄入太高可能导致新生大鼠的认知能力障碍和海马体发育异常,简单说就是不太聪明。相关论文发表于Experimental Neurology。Tamashiro教授(左)和论文一作Zachary A.Cordner(右)与实验用的大鼠玩具。图片来源:Johns Hopkins University School of Medicine研究人员给怀孕的雌性大鼠喂食高脂饲料(其中60%的能量由脂肪提供),并一直持续到幼鼠断奶。在这三个月时间里,这些雌性大鼠完全可以放飞自我,尽情吃它们“梦寐以求”的美食,绝不限量!幼鼠断奶后的三个月里,研究人员给它们吃正常的大鼠饲料(其中仅有20%的能量来源是脂肪)。这么做的目的是为了排除幼鼠自行进食产生的影响。这样一来,这些幼鼠的任何异常行为,便可以直接归因于它们妈妈的饮食结构。如何判断大鼠的大脑发育水平呢?科学家自然有一套评价方法啦。第一个实验是迷宫实验。大鼠不喜欢空旷的空间,它们的天性就是找到遮挡物。因为它的祖先暴露在野外会招致捕食者凶残的目光,为了生存它们必须隐藏自己。正常大鼠在迷宫中往往尝试三四次后就能找到迷宫的出口,奔向安全的遮挡物。实验发现,高脂饮食雌鼠所生的后代需要九次才能找到正确的出口。这“智商”差距是相当明显啊。Barnes迷宫示意图。圆盘的小洞中只有一个洞下面可以躲藏,大鼠在几次探索后会找到那个正确的位置。图片来源:Behavioral Research高脂饮食雌鼠所生的后代在迷宫中探索的时间明显更长。图片来源:Experimental Neurology另一个积木实验则更侧重于大鼠记忆力方面的测试。大鼠通常对新事物很好奇,喜欢在它们活动的区域探索新的物品。第一天,在大鼠的笼中放它们熟悉的几块积木。第二天研究人员会用一块新积木替换旧积木,正常大鼠会花费较长时间去摸索新积木。而在高脂饮食雌鼠所生的后代笼中放入新积木,两次探索的时间差不多,这意味着这些大鼠的记忆中,两种积木都挺陌生。它们的记性比对照组的同类差了一截。高脂饮食雌鼠所生的后代对新物品的识别能力降低。图片来源:Experimental Neurology以上两个实验都证明,高脂饮食雌鼠后代的学习能力更差。研究人员试图从基因表达的角度解释这种现象的原因。海马体的发育直接关系到哺乳动物的学习能力和记忆力。而且海马体的发育特别容易受到外界刺激的影响。因此研究人员考察了海马体上的基因表达变化。研究人员发现在高脂饮食雌鼠后代的海马体中,胰岛素受体(INSR)、瘦素受体(LEPR)和葡萄糖转运蛋白1(SLC2A1)基因的表达显著降低。这三个基因都与大鼠的能量利用密切相关。胰岛素受体参与血糖调节;瘦素受体与抑制饥饿的瘦素结合,调节体重和代谢;葡萄糖转运蛋白1则是细胞摄入葡萄糖的主要运输工具。由此可见,大鼠海马体中参与能量代谢的基因也会影响大鼠的学习和记忆。高脂饮食雌鼠所生的后代与正常大鼠海马体基因表达的比较。图片来源:Experimental Neurology考虑到大鼠和人类的基因相似性,这些现象很可能在人类身上也会发生。西方社会常见的饮食中脂肪供能约占45%,略低于研究中孕期大鼠食用的高脂饲料(60%)。中国人的日常饮食中脂肪占比可能会低一些,但怀孕期间额外的营养供应会使脂肪摄入显著提高。所以妈妈们在孕期和哺乳期吃得太油腻了,不仅仅可能涉及到胎儿太大不易生产的问题,还可能会影响孩子的大脑发育。不过据说很多准妈妈并不真的想吃那么多大鱼大肉,奈何老一辈太过热情,觉得各种好东西一定要给准妈妈和未来的孙子孙女吃足了才健康。长辈做好了又不能浪费,有时妊娠反应又让不少准妈妈吃不下,最后的结果就是——准爸爸也会跟着发胖。这真真是“殃及池鱼”啊!不知道准爸爸们发胖会对孩子有什么影响?本氘十分期待科学家们的深入研究。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Maternal high-fat diet results in cognitive impairment and hippocampal gene expression changes in rat offspringZachary A. Cordner, Seva G. Khambadkone, Gretha J. Boersma, Lin Song, Tyler N. Summers, Timothy H. Moran, Kellie L. K. TamashiroExperimental Neurology, 2019, 318, 92-100, DOI: 10.1016/j.expneurol.2019.04.018(本文由氘氘斋供稿)

来源: X-MOL 2019-10-02

《自然-通讯》:利用新型人工蛋白骨架精准组装细胞内代谢关键节点进而汇聚代谢流

如果说细胞是一个微型工厂,那么细胞内的酶就是这个工厂内的机器,这些纳米级别的机器无时不刻的催化着细胞内的多种化学反应。天然的生物催化体系通常在细胞这个微型工厂内会形成物理上、空间上组织有序的多酶复合体、酶分子脚手架或者反应微区,这种类似机器组装的高度组织性带来了高效的催化能力。然而,目前合成生物学中构建的人工合成体系失去了自然系统原有的协调运行机制,不但大大降低了整体的催化效率,也会导致代谢流不平衡,使带有毒性的中间产物发生积累进而增加了宿主细胞的代谢压力。武汉大学刘天罡(点击查看介绍)课题组、香港中文大学夏江(点击查看介绍)课题组近期在Nature Communications 联合发表了题为“Modular enzyme assembly for enhanced cascade biocatalysis and metabolic flux”的论文,香港中文大学康巍博士、武汉大学马田博士为本文共同第一作者。该研究采用一种人工蛋白骨架结构,该结构基于一对简单的多肽相互作用标签RIAD和RIDD,实现了两种酶体外以及体内的有效组装。RIDD是一段来源于cAMP依赖的蛋白质激酶A的由四十四个氨基酸构成的多肽,RIAD则是一段来源于激酶A锚定蛋白质的仅由十八个氨基酸构成的两亲性多肽。RIDD会自发形成生理条件稳定的二聚体,RIAD则会进一步与RIDD二聚体结合,形成稳定的三聚结构。通过在目的蛋白上分别融合表达这一对多肽标签,就能实现两个酶体外和体内的组装。该体系有以下几个优点:1)多肽标签较短,降低对酶本身活性的影响;2)亲和力高,能够确保酶复合物的完整性;3)能够以2:1的比例进行酶组装;4)可以将不同表达强度的酶在不改变酶结构的前提下,进行空间组装;5)特异高效结合,且生理状态下稳定。首先,作者利用维生素K生物合成中的酶进行了体外组装实验。利用该技术进行体外组装时,能够观察到RIAD和RIDD可以有效地介导相关酶形成多种形态、催化亚基比例各异的多酶复合物,并且多肽标签并不会影响催化亚基的催化活性。通过调节催化亚基比例,多酶连续催化反应效率可以人为地进行调控,并在增加多比例组装时进一步提升产量。图1. MenD4-MenH2 (Assembly A), MenD4-MenH8 (Assembly B) and MenD4-MenH16 (Assembly C)酶组装体在透视电镜下的聚合结构更重要的是,该技术同时在微生物体内针对重要的代谢节点实现了有效组装。萜类是自然界中最为丰富的一类化合物,在生物医药、能源、食品和化妆品领域有着广泛应用。其合成途径可分为上下游,上游部分提供萜类合成前体——异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP);下游部分则通过对前体进行缩合、环化、氧化等一系列修饰,最终生成多样的萜类化合物。Idi为上游代谢途径的最后一个酶,负责催化IPP和DMAPP的异构化反应,该酶游离在细胞质内;CrtE是下游类胡萝卜素生物合成的第一个酶,然而,该酶分布在细胞膜上。IPP和DMAPP作为萜类合成的通用前体,当靶向合成类胡萝卜素时,上下游的空间效应降低了人工细胞工厂的合成效率,同时,上下游的不平衡也导致IPP和DMAPP的积累进而抑制了细胞生长。图2. 在细胞内组装类胡萝卜素生物合成的关键限速酶。(a) 不同空间分布的上下游关键节点酶的组装示意图;(b) RIAD-RIDD肽相互作用使Idi从细胞质再分配到细胞膜;(c) Idi-CFP和CrtE-YFP发生共定位。通过利用RIAD-RIDD组装构建Idi-CrtE多酶复合物,作者在分布膜蛋白CrtE的细胞膜上发现了大量的Idi,同时,类胡萝卜素的合成通量发生了极大地提高。该技术将原本存在物理分割的代谢通路实现了链接,Idi-CrtE多酶复合物如同一个纽带,将更多的萜类合成前体引流至下游目标途径。通过在虾青素大肠杆菌高产菌株体内构建Idi-CrtE多酶复合物,虾青素产量提高了2.7倍,类胡萝卜素产量提高了5.7倍。通过在番茄红素酿酒酵母高产菌株体内构建Idi-CrtE多酶复合物,番茄红素产量提高了58%,达到2.3 g/L,与目前报道的酿酒酵母产番茄红素的最高产量在同一水平。图3. Idi-CrtE多酶复合物分别在大肠杆菌 (a) 和酿酒酵母中提高了 (b) 目标途径的代谢通量图4. 由RIAD-RIDD介导的代谢关键节点组装促进微生物细胞工厂的高效合成通过构建多酶复合物的方式链接生物合成的关键代谢节点来实现目标途径产量的提升,尤其针对具有不同空间分布酶的人造代谢体系,不仅解决了底物传递通道问题,也减轻了人工代谢体系的不平衡问题,对于实现目标产物的创新高产具有重要意义。该技术丰富并拓展了人工蛋白骨架的应用环境及适用范围,是目前人工蛋白骨架技术发展中非常适合微生物体内使用并且实用有效的一种技术,其不仅为萜类化合物的高效合成提供一种新的策略和思路,也为多酶组装的相关应用及发展提供一个新的突破口。开发能够实现更复杂体系组装的人工蛋白骨架技术无疑将是未来合成生物学的一个热点。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Modular enzyme assembly for enhanced cascade biocatalysis and metabolic fluxWei Kang#, Tian Ma#, Min Liu, Jiale Qu, Zhenjun Liu, Huawei Zhang, Bin Shi, Shuai Fu, Juncai Ma, Louis Lai, Sicong He, Jianan Qu, Shannon Au, Byung Ho Kang, Wilson Lau, Zixin Deng, Jiang Xia*, Tiangang Liu*Nat Commun., 2019, 10, 4248. DOI: 10.1038/s41467-019-12247-w导师介绍刘天罡https://www.x-mol.com/university/faculty/50001 夏江https://www.x-mol.com/university/faculty/53892

来源: X-MOL 2019-09-23

张文彬课题组发展蛋白质异质索烃的“活性模板”制备方法

拓扑在数学上指图形在连续形变中所保持不变的空间性质,在化学领域则被用来描述分子在不断裂化学键的前提下保有的原子间和链段间的连接关系和空间关系。在高分子中,拓扑结构常常是调控高分子物理性能与功能的重要参数。在生命体系中,由于受到其生物合成机制的限制,新生蛋白质的主链拓扑结构均为线性结构。自然界中仅存在少数非线性拓扑蛋白质(如套索蛋白、打结蛋白以及索烃蛋白等)。从这些有限的例子中,人们发现拓扑结构可赋予蛋白质额外的稳定性和生物功能。因此拓扑调控有望成为蛋白质工程的一种新策略。目前,人工设计的拓扑蛋白质结构仍然较少,其合成方法单一,亟需发展新的合成方法,以适应更多样、更复杂的拓扑结构的制备。 近期,张文彬(点击查看介绍)课题组发展了一种“活性模板”合成方法,可一步在胞外或胞内实现蛋白质异质索烃的高效制备。“活性模板”的概念最早见于小分子机械互锁结构的制备。它主要利用金属离子预组装各反应组分并进而催化形成共价键,从而固定其机械互锁结构。该研究借鉴了这个方法,通过重新设计SpyTag-SpyCatcher复合物中三个片段(SpyTag/BDTag/SpyStapler)之间的连接关系,在三维空间中人为引入链缠结,从而开发了与生理条件兼容的可用于合成蛋白质异质索烃的“活性模板”方法(图1),在细胞外或细胞内都实现了蛋白质异质索烃的简单模块化合成。后期测试亦表明该种索烃化方式不会影响到蛋白质的三维结构,而且相对于线性结构和环状结构,索烃结构表现出更好的耐蛋白酶水解能力、耐加热变性以及耐机械变性的能力。这意味着蛋白质异质索烃结构在工业酶工程和蛋白质药物中具有一定的潜在应用价值。另外,该方法也展现出广阔的前景,不仅其效率有望利用定向进化技术得到进一步的提升,还有可能发展多种相互正交的活性模板,一步实现高级索烃的简洁制备。图1. 蛋白质异质索烃的“活性模板”合成方法该研究近期在线发表于Angew. Chem. Int. Ed.。北京大学化学与分子工程学院博士生达晓娣为该论文第一作者,张文彬研究员为论文通讯作者。该工作得到国家自然科学基金和北京大学医学交叉研究种子基金的支持。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Active Template Synthesis of Protein HeterocatenanesXiao‐Di Da, Wen‐Bin ZhangAngew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 11097-11104, DOI: 10.1002/anie.201904943张文彬博士简介张文彬,北京大学化学与分子工程学院及软物质科学与工程中心特聘研究员,博士生导师。2004年获北京大学化学学士学位;2010年获美国阿克伦大学高分子科学博士学位,其后先后在阿克伦大学和加州理工学院从事博士后研究。2013年8月加入北京大学,建立精密结构大分子实验室,其研究兴趣主要在于通过理性设计结合合成体系和生物高分子的优点,实现对化学结构和物理结构的精确控制,发展先进功能杂化材料,并应用于与健康和能源相关的领域。目前主要研究领域为基于重组蛋白质的生物材料及其在生物医学上的应用。至今为止,已在Science, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Cent. Sci., Adv. Mater., ACS Nano, Mater. Horiz., Macromolecules 等国际重要学术期刊上共发表SCI论文116篇,其中89篇为第一或通讯作者,总他引2700余次。获授权国内外发明专利三项,参与撰写五本英文书籍,一本中文书籍。研究成果曾被Science、C&EN、Nat. Sci. Rev.、Faculty1000Prime、JACS Spotlight、China Mater.、《中国科学基金》等专题报道。曾获得日本化学会Distinguished Lectureship Award等奖励。https://www.x-mol.com/university/faculty/8713

来源: X-MOL 2019-09-21

Nature子刊:看蛋白序列,预知化合物结构

提到天然来源化合物的结构预测,科研小伙伴们首先想到的是测个质谱(MS)、做个核磁(NMR)?或者再来个紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)?“四大名谱”都凑齐了,还怕推测不出结构?再不行,养个单晶总能看清楚了吧。等一等,要做这些测试,你至少得先有纯度不影响解析结构的化合物,这就要走几轮色谱分离,颇要花费一些时日了。对于做微生物来源天然产物的小伙伴来说,有些“隐士”微生物培养都成问题,更别说取其产物了。如果能预测产物结构,那就能提前决定一株菌有没有深入做下去的价值。“需要一株好菌保平安(毕业)”,这成为微生物药物研究小伙伴的真实心声和美好期待。这时,你需要“一双慧眼”来看清蕴藏于微生物的化合物宝藏。这双慧眼,就是基于生物序列数据库的生物信息研究工具。本文介绍的就是这样一个通过蛋白质序列信息预测化合物结构的案例。瑞士苏黎世联邦理工学院(ETH Zürich)微生物研究所的Jörn Piel教授团队和欧洲分子生物实验室-欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)的Pablo Moreno教授团队在Nature Chemical Biology 上发表论文,研究对象是细菌反式乙酰转移酶聚酮合酶(trans-acyltransferase polyketide synthases, trans-AT PKSs)及其聚酮类代谢产物。Trans-AT PKSs这类酶能产生结构复杂的聚酮类化合物,这些代谢产物具有抗菌、抗癌等多样化的生物活性,但是Trans-AT PKSs往往存在于“隐士”微生物中,研究较少,这影响了对于聚酮类化合物的进一步研究。研究者提出了一个“清奇”的想法——根据Trans-AT PKSs的序列信息来预测它们产物的化合物结构。“工欲善其事,必先利其器”。为了发展这类聚酮产物的有效预测工具。他们分析了目前已知全部54个已鉴定出产物结构的trans-AT PKSs,发现这些体系有160个不同的模块,并且发现绝大多数模块遵循聚酮类化合物合成的共线性模式(colinear fashion)。他们进一步以系统分类方式分析54个生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)的所有655个聚酮合酶(ketosynthase, KS)序列,构建“日晷式”系统进化树(图1)。这一分析揭示出大量多样化的聚酮合酶序列亚分支,涉及到起始单元、中间单元连接、多种单元化学修饰、甚至影响产物手性立体结构或区域结构(例如,L-OH或D-OH;α,β-或β,γ-双键的变化)。这些分析积累了大量预测产物结构的基础信息。图1. 将已知trans-AT PKSs BGCs中所有KS序列分类构建“日晷式”系统分类发育树(左),对时间进行系统分类的日晷(右)。图片来源:左图来自Nat. Chem. Biol.,右图来自网络将聚酮合酶分支与产物结构属性进行系统归属后,他们开发出trans-AT PKSs的产物预测工具TransATor。将一条连锁PKS蛋白序列以FASTA格式输入该软件,它可以注释比较每一个KS和PKS细节区域,尤其能探测出trans-AT PKSs中的涉及化学产物的结构信息,如乙酰水解酶(acyl-hydrolase, AH)、分支化(branching, B)、C3-乙酰基转移酶(C3–acyltransferase, FkbH)、羟基化后的绝对构型等信息。整个产物结构预测过程,涉及基于隐马尔采夫模型(Hidden Markov Models, HMMs)的聚酮核心区域注释和聚酮化合物结构预测,使用EMBOSS fuzzpro patterns预测化合物羟基化碳原子的绝对构型,最后用化学开发工具盒(Chemistry Development Kit, CDA)构建聚酮产物结构,其PKS共线性组合化合物的过程,类似于工厂流水化生产装配线(图2)。图2. TransATor预测trans-AT PKSs产物化学结构的工作流程(左),工厂生产装配线(右)。图片来源:左图来自Nat. Chem. Biol.,右图来自网络经过一番网络验证和调试。TransATor大显身手的机会到了。他们选择一株来自海洋苔草植物根际的细菌Gynuella sunhinyii YC6258(内含未鉴定的trans-AT PKSs基因簇),利用TransATor分析其中一个trans-AT PKSs,发现此类系列有极高可能产生具有抗菌活性的tartrolon类聚酮化合物。为了验证所预测的结构,他们对Gynuella sunhinyii YC6258进行培养发酵,分离纯化,最后分离鉴定出3个tartrolon类化合物,其中1个与预测结构完全吻合,另外两个高度相似(图3)。图3. 利用TransATor预测tartrolon结构与实际分离到结构比较。图片来源:Nat. Chem. Biol.随后,他们选择菌株Leptolyngbya sp. PCC 7375的trans-AT PKSs基因簇,输入TransATor进行分析,预测出其含有的化合物类似于虾毒素phormidolide和oscillariolide,但大环的规模和结构不同,极有可能是一个新聚酮核心结构。为了验证预测结构,他们也对Leptolyngbya sp. PCC 7375培养发酵,分离纯化和结构解析,得到3个化合物分别命名为leptolyngbyalide A,B和C(图4)。由于3个化合物分离出的量有限,暂时不能进行绝对构型验证。但有趣的是,TransATor分析显示这些化合物与phormidolide类绝对构型相反。重新分析phormidolide的数据更支持TransATor预测结果,这使得phormidolide的绝对构型数据可能需要重新分析并加以修正。图4. 利用TransATor预测leptolyngbyalide结构与实际分离到结构比较。图片来源:Nat. Chem. Biol.为验证TransATor能否在从未开发的细菌中发现新骨架化合物,他们选择一株分离自海绵的细菌Aquimarina sp.,将其所含trans-AT PKSs基因簇进行分析,预测出产物具有leinamycin型含硫杂环结构。经培养发酵,分离纯化,得到了两个与预测结构相吻合的化合物,其中一个化合物含硫,且都代表了trans-AT PKSs的一种新骨架类型(图5)。图5. TransATor预测出新骨架化合物。图片来源:Nat. Chem. Biol.也许一株好菌里面有非常好的化合物资源,但却与我们有着“世界上最遥远的距离”——你就在面前那个小瓶子里,我却不认识你。Jörn Piel教授和Pablo Moreno教授团队基于生物信息学技术和现有大数据,开发出TransATor填补了这类空白,通过酶序列预测代谢产物的结构骨架特征,从而指导后续的靶向分离,以鉴定出结构新颖、具有生物活性的天然来源化合物。这一研究为天然来源化合物开发提供了一个新思路,或许很多人研究中“最遥远的距离”将不再是距离。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Automated structure prediction of trans-acyltransferase polyketide synthase productsEric J. N. Helfrich, Reiko Ueoka, Alon Dolev, Michael Rust, Roy A. Meoded, Agneya Bhushan, Gianmaria Califano, Rodrigo Costa, Muriel Gugger, Christoph Steinbeck, Pablo Moreno, Jörn PielNat. Chem. Biol., 2019, 15, 813–821, DOI: 10.1038/s41589-019-0313-7导师介绍Jörn Pielhttps://www.x-mol.com/university/faculty/2833 (本文由水村山郭供稿)

来源: X-MOL 2019-09-20

华东师范大学研发非线性DNA分子电路用于生物分析

近日,华东师范大学在合成生物计算机方面取得新进展,基于超灵敏分子开关的非线性输入/输出的生物学特性,通过协同变构基元组合实现DNA分子电路的非线性输入/输出行为,并基于此实现了对生物分子的超灵敏测量。相关研究结果发表在ACS Synth. Biol.。2018年,Cell杂志发表专访“未来是合成生物学的天下”,指出合成生物系统和分子越来越多地被用来推动生物应用和发现,发展工程化分子电路式生物合成手段或许推动21世纪的制造业。迄今为止,生物学还没有接近成为一门工程学科,我们需要更好地扩展对生物学的理解,并将其与分子计算机设计原则相结合,以使我们能够构建分子或工程化电路,或者按照需要运行的整个基因组。化学反应网络是衔接从低维度的生物信息到高维度的生物行为的关键,其中非线性是最为普遍存在的调控方式。生物体利用复杂的化学反应网络执行精细的生物功能,比如自组织、细胞分化和迁移。具有信息处理功能的合成生物电路的发展为分子诊断、智能治疗和适应性材料等的进一步发展提供了新的机遇。为此,基于DNA链置换技术的无酶DNA分子反应体系由于其特定的碱基结合规则和可预测的动力学行为受到大家的青睐,例如利用核酸反应网络构建的纳米器件、成像处理、布尔逻辑电路和类神经元计算等功能。但是,纯DNA化学反应网络线性的速率响应关系使得它无法实现剧烈的速率转变,限制了它在以非线性输入/输出为基础构建精细复杂功能的化学反应网络上的进一步应用。针对这一问题,华东师范大学裴昊教授指导博士生赖魏成功构建了具有非线性输入/输出行为响应的DNA分子电路。利用超灵敏分子开关的生物学特性,结合协同变构基元实现了DNA分子电路的高阶非线性输入/输出行为。其中协同变构基元具有配体响应的特点,当结合一个配体时会增加基元对下一个配体结合的亲和力,类似于血红蛋白对氧分子的正协同结合作用。只有在两个结合以上结合位点存在时,DNA反应基元对配体浓度的响应才呈现S型的非线性关系。该策略的创新之处在于巧妙利用了DNA发夹结构的变构与配体响应的协同结合机制,既能保证DNA化学反应网络的可编辑特性也可以根据配体设计对应的结合适配体,从而保证该策略在DNA化学反应网络上的通用特性。这些超灵敏分子开关是真核细胞的信号网络形成高阶非线性行为的核心组件,其功能是将小的输入信号的变化转化为输出信号的极大变化,从而实现非线性的输入/输出控制。其超灵敏的配体浓度响应特性为智能分子诊断和检测提供了新的思路。该研究工作得到了国家自然科学基金委优秀青年基金和上海市启明星计划的支持。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Nonlinear Regulation of Enzyme-Free DNA Circuitry with Ultrasensitive SwitchesWei Lai, Xiewei Xiong, Fei Wang, Qian Li, Li Li, Chunhai Fan, Hao PeiACS Synth. Biol., 2019, DOI: 10.1021/acssynbio.9b00208导师介绍裴昊https://www.x-mol.com/university/faculty/39473

来源: X-MOL 2019-09-19

比人类早数百万年的细胞内置控制系统

控制理论和控制工程是一门维持动态系统稳定的学问。听起来似乎有点高深,但生活中随处可见。例如在炎炎夏日,人们最离不开的空调就是控制理论的典型应用。室温高于设定温度时就制冷,达到设定温度时停止制冷,室温过高就大功率工作,室温稍高就小功率干活,如此循环。还有那能保温的电饭煲也是这道理。再复杂点的,比如自动档汽车的变速箱,各种无人机,甚至无人驾驶汽车、飞机、火箭、太空船……人类的控制理论大约创立于150年前。其实,还有比这应用更久远的控制系统,可能早了几百万年——那就是大自然在细胞中内置的控制系统,远比人类工程师设计的精妙神奇。细胞内有两个重要信号通路控制着细胞的生长——雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)通路和蛋白激酶A(Protein Kinase A, PKA)通路。这两条通路都能响应营养物质,控制细胞生长。根据以往的研究,TOR通路和PKA通路在进化上非常保守,说明其功能非常重要。当TOR或PKA突变时,人体会产生一系列疾病。来自美国亚利桑那大学的Andrew Capaldi团队思考了一个问题,两条通路既然功能比较类似,为什么要同时存在呢?它们究竟是如何协同调控细胞生长的呢?他们在常用的模式生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行了相关研究,发现雷帕霉素靶蛋白复合物1(target of rapamycin complex 1,TORC1)(TOR的一种)和PKA共同调节酵母核糖体和蛋白质合成,TORC1通路能够响应细胞内部的一些代谢物(如氨基酸)来精确调控酵母生长速度,而PKA通路则对外部的营养物质(如葡萄糖)非常敏感,能够快速适应外界的变化。酵母TORC1和PKA共同调节核糖体和蛋白质合成。图片来源:Nat. Commun.为了研究这两种通路各自的功能,研究人员先把酵母养在含甘油的培养基中,此时PKA活性很低。当把葡萄糖添加到培养基中,酵母的PKA通路被激活,在极短时间内上调核糖体相关的RNA表达。20分钟左右,核糖体相关RNA平均上调了6倍左右,其中NSR1更是暴增25倍。这就好比饥肠辘辘的酵母细胞在葡萄糖溶液中大快朵颐,并以“肉眼可见”的速度变胖。PKA在葡萄糖刺激下快速上调核糖体相关RNA表达。图片来源:Nat. Commun.不过盛宴不是无尽的,当酵母进入对数生长期,核糖体RNA水平会逐渐下降,当然相应的蛋白合成也会变慢。逐渐的变慢的过程需要一个小时以上。为了进一步研究TORC1和PKA通路各自的功能以及协作关系,研究人员用TORC1抑制剂雷帕霉素和PKA抑制剂1-NM-PP1分别或共同处理细胞,观察在葡萄糖刺激下,核糖体RNA的表达水平变化。TORC1和PKA通路分别和共同被抑制后核糖体RNA表达变化。图片来源:Nat. Commun.在没有葡萄糖时,酵母依赖TORC1调节核糖体RNA表达,这在自然界也是有意义的,毕竟酵母不是随时都有甜蜜大餐可吃。加入葡萄糖20分钟时,核糖体RNA水平上调几乎只受PKA通路调节,核糖体RNA猛增六七倍,这段时间TORC1表现得可有可无。时间到90分钟和150分钟,细胞开始受到这两种通路的共同调节,其生长速率趋于稳定。具体而言,TORC1通路一如既往得想要上调核糖体RNA,但此时的PKA进入负反馈调节的状态,起到减速作用。最终的结果是核糖体RNA水平仅为甘油培养时的2.5倍。研究表明,TORC1和PKA是通过对Dot6/Tod6的调节影响下游核糖体和蛋白的合成。当然,如果葡萄糖耗尽,PKA通路暂时休息,之前积累的Dot6/Tod6分解完后,细胞将恢复到最初的甘油培养状态。TORC1通路和PKA通路参与的酵母细胞生长控制系统。图片来源:Nat. Commun.可以说这套控制系统相当精巧,快速高效利用能量物质。据研究,人体细胞含有约30000种蛋白,其中有几千种与生长有关,任意一种蛋白出问题都可能导致某种疾病。这些蛋白彼此间连缀成巨大的网络系统,使细胞能够快速响应环境的变化,以合适的速度生长。TOR通路和PKA通路就是这个大型网络系统的中枢之一,它们控制着这个网络的稳定运行。如果中枢出现问题,必然会导致严重的疾病。例如TOR水平过低,会导致抑郁症;过度活跃的TOR和PKA会导致癌症、癫痫等疾病。我们对细胞控制理论的更好理解,或许才是找到“灵丹妙药”治疗顽症的关键。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Integrated TORC1 and PKA signaling control the temporal activation of glucose-induced gene expression in yeastJoseph Kunkel, Xiangxia Luo, Andrew P. Capaldi Nat. Commun., 2019, 10, 3558, DOI: 10.1038/s41467-019-11540-y(本文由氘氘斋供稿)

来源: X-MOL 2019-09-13

Nature Chem.:小小气泡,生命原点?

“生命起源于何处”是一个困扰了人类上万年,在可预见的未来也将会一直困扰下去的终极问题。随着新科技新理论的发展,一些合乎逻辑的答案正在慢慢涌现。近期,德国慕尼黑大学Dieter Braun教授领导的一支多学科研究团队在Nature Chemistry 上发表了一项颇为出人意料的研究成果,他们指出加热液体时产生的小小气泡,可能是地球生命的原点。小小气泡可能是生命起源的原点。图片来源于网络越来越多的人相信,生命起源于偶然——远古海洋中C、H、O、N、P、S原子随机碰撞产生了磷脂、核酸、氨基酸的前体,它们之间随机组装进行了不知道多少亿年,直到第一个远古细胞结构横空出世。可是,这个过程中涉及了无数种“可能”与“随机”,即使在时间跨度上加上了数十亿年的光景,似乎也不足以使产生细胞结构的可能性从零向上突破一点点。如果生命真的起源于偶然,那么或许存在某种特殊的环境能够提高随机碰撞的几率,为复杂的化学反应提供环境基础。海底火山因为具有丰富的元素储备、充足的能量、多样的催化条件,被认为是生命起源的基本场所,但是海底火山的什么位置才是生命起源的原点呢?作者盯上了火山中多孔的火山岩。熔浆的热量传导至这些火山岩时,会产生大量气泡,而当这些气泡受热不均时,则会为化学反应提供浓缩与富集的特殊场所。研究人员利用3D打印构建了模拟火山岩的微流控器件,用于观察重要的生命分子在液-气界面的动力学行为。图片来源:Nat. Chem.研究人员利用3D打印制作了一个多孔的微流控器件来模拟火山岩的结构,并使其部分被水淹没。对该器件局部加热后,器件内部会产生温差,在脱气原理的作用下,高温的部分会自发地产生大量气泡。气泡周围的DNA分子发生了明显的聚集。图片来源:Nat. Chem.随后,包括RNA前体、寡核苷酸、脂质等被认为是对生命起源至关重要的分子被加入到水中。这些分子被荧光标记,以便利用快速高分辨的荧光显微镜追踪其动力学过程。结果显示,所有这些分子都会在微流控器件中以非平衡的状态分布——液-气界面处的分子浓度不停地变化,最高时能够产生高于本底溶液数倍的浓缩效果。聚集在液-气界面的分子会进入气相并在高温气体的作用下破坏其水化层,当气泡受到重力作用向上运动时,这些分子又会发生再水化作用,被气泡“拖动”一同运动,而这一过程的反复进行则会显著地提高气泡周围分子的浓度。用荧光成像记录到气泡周围的核酸分子被脂质形成的囊泡包裹。图片来源:Nat. Chem.通过30分钟的持续观察,研究人员记录到了5种对产生原始细胞至关重要的反应过程,包括:(1)脱水-浓缩循环为RNA磷酸化的关键反应提供了可能;(2)核酶催化活性的提高;(3)RNA分子在水凝胶中浓缩;(4)RNA的前体产生结晶;(5)双亲性的脂质发生聚集并形成囊泡,一些囊泡包裹寡核苷酸片段,囊泡的组成与大小产生明显的分化。经过这五种关键过程,形成基本细胞结构的可能性将大大增加。仅仅在30分钟内就能够记录到如此多的变化。考虑到基本元素历时数十亿年的反应过程,生命形成的概率似乎能够提高到可以被接受的范围内。气泡周围核酸分子磷酸化能力的增强。图片来源:Nat. Chem.Dieter Braun教授展望到,该课题组下一步将考虑向反应体系中加入结构完整、可以被催化复制的核酸,观察是否能够记录到核酸的复制过程。另外,该研究的意义不仅仅在于对生命起源的探究,研究分子在液-气界面特殊的动力学特性,很可能会为催化反应、聚合反应提供一些新的思路,开创一些崭新的领域。总结来说,该研究对于原始细胞的产生提供了一个新颖的、在一定程度上让人信服的答案。然而,生命的起源仍然存在一个巨大的空白——对生命形成至关重要的分子到底是怎么形成的。由于该研究直接向水中加入了RNA前体等物质,相当于是站在这些物质已经事先存在的基础上来探究生命的起源。很显然,在几十亿年前,这些具有生物功能的分子不会凭空出现,所以基本化学元素、简单的无机分子到底是通过什么途径变成复杂的核酸、酶、多肽等生化分子的,仍然是一个未解之谜。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Heated gas bubbles enrich, crystallize, dry, phosphorylate and encapsulate prebiotic moleculesMatthias Morasch, Jonathan Liu, Christina F. Dirscherl, Alan Ianeselli, Alexandra Kühnlein, Kristian Le Vay, Philipp Schwintek, Saidul Islam, Mérina K. Corpinot, Bettina Scheu, Donald B. Dingwell, Petra Schwille, Hannes Mutschler, Matthew W. Powner, Christof B. Mast, Dieter Braun Nat. Chem., 2019, DOI: 10.1038/s41557-019-0299-5(本文由传光簇供稿)

来源: X-MOL 2019-08-30

一箭双雕:声免疫治疗仿生捕获器对抗多药耐药细菌感染

抗生素的出现和发展为人类应对感染性疾病提供了简单有效的治疗方法,极大的改善了人类的健康水平。然而由于抗生素的滥用和过度使用,新型超级耐药细菌的不断出现,成为全球公共卫生面临的严峻挑战。随着“超级细菌”的迅速蔓延,“后抗生素时代”的步步逼近,寻找新的抗菌药物及治疗方案是这场人类与细菌博弈战中亟待解决的难题。近期,厦门大学刘刚教授(点击查看介绍)团队提出了一种用于桥接抗菌声动力疗法和抗毒素免疫疗法的生物启发策略(图1)。该声免疫治疗仿生捕获器为无抗生素疗法对抗多药耐药细菌感染提供了新的诊疗一体化技术手段。图1. 桥联抗菌声动力疗法和抗毒素免疫疗法的声免疫治疗纳米捕获器示意图作为一种新兴的疾病治疗手段,抗菌声动力疗法通过低频超声刺激声敏感因子(即声敏剂)产生活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS),从而对细菌造成不可逆转的损伤。尽管该疗法具有高度广谱杀菌活性且不诱导耐药性产生,但是有限的ROS产生效率使其在现阶段的技术条件下不足以及时且彻底的治愈细菌感染。有别于这种直接杀伤细菌的治疗手段,抗毒素疗法选择性地中和细菌分泌的毒性因子、解除其致病毒性,以治疗细菌感染性疾病。作为一种被动免疫疗法,它能够有效保护宿主固有免疫系统免遭细菌毒素破坏。进一步与抗菌疗法联用后,即使是感染“超级细菌”,如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA),也有望被这种一箭双雕的疗法治愈。受到机体内的胞外囊泡作为天然的膜蛋白载体的启发,刘刚教授团队在前期基因工程化细胞膜囊泡的工作基础上(PNAS, 2015; Angew Chem, 2018; Adv Mater, 2018; Nano Lett, 2019),在细胞膜表面定向表达展示用来中和MRSA细菌α-毒素的抗体,并用此细胞膜形成纳米囊泡,进行声敏剂的包封。该纳米囊泡能够通过抗体中和作用,高效捕获MRSA细菌分泌的α-毒素;超声激活后,声敏剂有效地产生ROS,破坏细菌细胞膜的完整性,诱导膜电位去极化,以杀死细菌并加速细菌毒素的清除。体内光学成像显示,抗体导向的纳米捕获器可以成功定位MRSA感染并准确地区分细菌感染病灶和无菌性炎症。原位磁共振成像和血氧饱和度光声检测无创实时监控了治疗进程,显示小鼠MRSA肌炎在声免疫治疗中被完全根除(图2)。该工作首次实现了抗菌声动力疗法和抗毒素免疫疗法的联合应用。这种一箭双雕的声免疫疗法为设计无抗生素的诊疗一体化抗菌策略提供了新的思路,有望解决了目前多重耐药菌感染难诊断、难治疗的困境。图2. (A)声免疫治疗仿生捕获器的抗菌抗毒素机制;(B)3D光声成像鉴别MRSA感染病灶与脂多糖诱导的无菌性炎症;(C)原位磁共振成像监测纳米囊泡介导的声免疫治疗进程。这一研究成果近期发表在Advanced Materials杂志上,并被Advanced Science News报道[1],文章的第一作者是厦门大学公共卫生学院刘刚课题组庞鑫博士。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Sono-Immunotherapeutic Nanocapturer to Combat Multidrug-Resistant Bacterial InfectionsXin Pang, Xue Liu, Yi Cheng, Chang Zhang, En Ren, Chao Liu, Yang Zhang, Jing Zhu, Xiaoyuan Chen, Gang LiuAdv. Mater., 2019, DOI: 10.1002/adma.201902530 导师介绍刘刚https://www.x-mol.com/university/faculty/39458 参考资料:1.https://www.advancedsciencenews.com/one-arrow-two-hawks-a-dual-approach-to-eradicating-bacterial-infection/

来源: X-MOL 2019-08-27

Angew. Chem.:可被细胞内不同活性氧正交激活的DNA模拟酶

可切割特定序列RNA的DNA模拟酶(DNAzymes)是一类极具应用潜力的短链核酸分子。它们被广泛的应用于在细胞内研究与生命活动密切相关的金属离子和基因表达。活性氧(ROS),例如过氧化氢(H2O2)和次氯酸盐(ClO-),是免疫激活、疾病演变及衰老等过程中的关键氧化应激介质。开发可被活性氧激活的DNA模拟酶,从而避免原始DNA模拟酶在细胞内的背景活性干扰,将使得DNA模拟酶成为精准的研究工具,用以揭示与活性氧相关的重要细胞生理过程中的奥秘。尽管已有多种光照激活的DNA模拟酶被成功开发并用于时空维度上的精准成像分析和基因调控,但是能对细胞中天然存在的重要化学物质活性氧产生响应并激活的DNA模拟酶仍未见报道。其挑战在于,如何将活性氧的化学特征与DNA模拟酶的活性强弱关联起来。清华大学化学系向宇副教授(点击查看介绍)课题组设计并合成了一类可被细胞内不同活性氧正交激活的DNA模拟酶。该项研究通过在DNA模拟酶的关键位点引入对过氧化氢敏感的苯硼酸酯修饰,建立了过氧化氢激活核酸切割活性的机制;同时,用能被次氯酸盐切割的硫代磷酸二酯结构连接DNA模拟酶及其抑制序列,使得次氯酸盐能够激活其核酸切割活性。上述两种修饰分别对过氧化氢和次氯酸盐具有高度的特异性,并与细胞内环境兼容,不仅可以响应外源活性氧刺激,也可以和细胞应激产生的内源活性氧迅速发生反应。利用这些修饰,课题组实现了在人和小鼠细胞内用过氧化氢和次氯酸盐正交激活两种DNA模拟酶切割不同序列的核酸底物,从而可将细胞内活性氧水平与成像分析及基因调控关联起来。以该项研究的方法和思路为基础,可以进一步开发更多可被活性氧正交激活的核酸模拟酶、核酸探针和核酸药物,为研究与氧化应激相关的免疫激活、癌症、衰老等细胞生理过程提供了有力的新工具。相关研究成果近日发表在国际化学期刊Angewandte Chemie International Edition 上,两位共同第一作者是课题组的博士研究生肖璐和博士后顾春梅,该项工作由国家自然科学基金资助完成。原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):Orthogonal Activation of RNA-Cleaving DNAzymes in Live Cells by Reactive Oxygen SpeciesLu Xiao, Chunmei Gu, Yu XiangAngew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201908105导师介绍向宇https://www.x-mol.com/university/faculty/12042 (本稿件来自Wiley)

来源: X-MOL 2019-08-11
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