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CCS Chemistry | 自供能的DNA纳米探针:信号扩增原位成像活细胞内的microRNA

摘要:南京大学徐静娟教授课题组报道了一种基于Binding-induced开启的自供能DNA motor-MnO2 纳米探针,实现了肿瘤细胞内微小核酸microRNAs(miRNAs)的原位成像分析。该方法以分子内结合诱导为触发机制,充分结合DNAzyme、纳米金和二氧化锰纳米片的信号放大检测的性能,兼具了集成度高、背景信号低和自供能等一系列优点,为活细胞内生物功能分子的高灵敏可视化分析提供了新的策略。

 

癌症一直是人类健康的主要威胁之一,预计将成为21世纪世界各国人口死亡的最主要原因和增加预期寿命的最大障碍。癌症存活率低的原因,主要是确诊较晚和缺乏及时有效的治疗方法。在复杂生理环境中构建高选择性、超灵敏的分析方法检测肿瘤标志物是目前癌症精准诊断面临的一大严峻挑战。近年来,纳米材料及DNA分子器件的发展为生物功能分子的高灵敏检测提供了新的契机。目前,已报道的DNA分子器件主要包括DNA机器人、弹簧和步行器等。它们中的大多数是由toehold介导的链置换反应、DNAzyme或酶催化的水解反应来驱动运行的,燃料DNA链和其他辅助因子(如金属离子)需要额外输送到细胞内,这增加了检测的复杂性和不准确性。为了在复杂的细胞环境中实现生物功能分子的简便检测,首先要克服以下两个困难:(1)动态纳米机器的所有组分都应当具有足够的生物相容性,并且可以一次性同时输送到细胞内;(2)纳米机器被目标物启动后,能够在细胞内自动运转,输出可靠的信号。

基于此,南京大学徐静娟教授课题组通过将纳米材料与DNA分子器件相结合构建了一系列特异性强、灵敏度高、自供能的纳米探针,实现了细胞内生物功能分子高灵敏的可视化分析,为癌症的早期诊断提供了新的思路。在此研究工作的基础上,他们将分子内的binding-induced触发机制与DNA分子器件、二氧化锰纳米片相结合构建了集成化、自供能DNA motor-MnO2纳米探针,并以疾病诊断标志物和潜在治疗靶点的miRNAs为目标模型,实现了活细胞内生物功能分子的原位成像(图1、2)。

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图片1.png 图1 DNA motor-MnO2纳米探针实现图片1.png活细胞内miRNAs原位成像的示意图


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 图 2.  DNAmotor-MnO2 纳米探针的合成和表征:(a)-(c)DNA-AuNP,MnO2 纳米片和 DNA motor-MnO2 纳米探针的 TEM 成像图。(d)图 c 中矩形框部分纳米材料中 Au、Mn、O 元素的分布图。

DNA motor-MnO2纳米探针由 DNA-AuNP、步行链(W,一端为 DNAzyme 序列)和 MnO2 纳米片组成,其中 DNA-AuNP 是底物链(S)、连接链(A)和单个 AuNP 的结合物。Cy5 标记的底物链(S)和连接链(A)通过 Au-S 键结合在 AuNP 表面,由于纳米金属表面能量转移(nanomaterial surface energy transfer,NSET)Cy5 的荧光被 AuNP 淬灭。基于 ssDNA 和 MnO2 纳米片之间的范德华力,修饰有 S 和 A 链的 AuNP 和步行链(W)组装在 MnO2 纳米片上,构建成集成化的DNA motor-MnO2纳米探针。当探针通过内吞作用进入细胞后,MnO2 纳米片被肿瘤微环境内的氧化还原物质谷胱甘肽(GSH)还原为 Mn2+,同时释放 DNA-AuNP 和 W 链。DNA-AuNP 和 W 链与目标 miRNA 相遇后引发以下自供能催化反应:目标 miRNA 与 A、W 杂交并连接在一起后,基于分子内的binding-induced 作用机制W 链一端的酶链部分与相邻底物杂交形成 Mn2+ 特异的 DNAzyme。在还原产物 Mn2+ 存在的情况下,底物链S裂解为两部分,Cy5 标记链释放且荧光恢复。剩余底物链无法与酶链形成稳定的双链结构进而释放酶链部分,使酶链与另一个相邻的底物链杂交,开启下一个DNAzyme酶切循环,进而触发自主和连续的荧光输出,实现了“一对多”的信号输出。如图3和4所示,研究人员验证了DNA motor-MnO2 纳米探针不仅可以在活细胞内正常工作,而且通过信号扩增策略原位“点亮”低丰度的miRNA-21,可以有效地区分肿瘤细胞与正常细胞,该方法具有很高的实用性。

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图 3. 细胞内miRNA-21的成像分析图:(a)不同条件下MCF-7 细胞的共聚焦荧光成像图(i)实验组:MCF-7 细胞+DNA motor-MnO2;、(ii)对照组:MCF-7 细胞+突变的 DNA motor-MnO2;(iii)空白组:MCF-7 细胞。(b)a中虚线部分对应的荧光强度图。

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 图 4.(a)DNA 马达-MnO2 纳米探针孵育的 MCF-10A 细胞、HEK-293 细胞、Hela 细胞和 MCF-7 细胞的共聚焦荧光成像图。(b)a中4组细胞的流式定量分析。(c)RT-PCR 定量分析。

与传统的 DNA 纳米探针相比,一体化的 DNAmotor-MnO2 纳米探针不仅具有简便、稳定的优点,且信号扩增步骤不需要借助酶和辅助因子,在活细胞成像中表现出明显的优势,为细胞内各种生物功能分子的可视化检测提供了一种强而有力的工具。本研究得到了国家重点研发计划,国家自然科学基金和南京大学优秀研究计划的资助。该工作以Research article形式发表在CCS Chemistry,并在官网“Just Published”栏目上线。

文章详情:

Smart Engineering of a Self-Powered and Integrated Nanocomposite for Intracellular MicroRNA Imaging

Mei-Rong Cui1, Xiang-Ling Li*, Hong-Yuan Chen& Jing-Juan Xu*

Citation:CCS Chem. 2020, 2, 2063–2073

文章链接:https://doi.org/10.31635/ccschem.020.202000419

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