Nano Res.│“一石二鸟”：氨基功能化的MSNs@Eu(OH)CO₃纳米探针用于溶解增强余辉发光生物检测
作者：Nano Research 2022-08-17
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原发性肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症以及由于癌症死亡的第三大病因。甲胎蛋白（AFP）通常被用作监测HCC的肿瘤标志物。灵敏地检测和追踪肿瘤标志物AFP能够为肝癌的早期诊断提供更多机会，并最终提高患者的生存率。近年来，很多免疫分析技术发展起来用于肿瘤标志物的检测，比如酶联免疫分析法（enzyme-linked immunoassay, ELISA）、放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）和时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）。其中TRFIA法具有灵敏度高、标记物化学稳定好等特点，在临床癌症诊断中得到了广泛的应用。 溶解增强发光生物测定方法（DELBA）是TRFIA方法的一个新分支，该生物测定法在标记过程中用Ln3+ 纳米粒子（Ln3+ -NPs）取代了商业解离增强镧系荧光免疫测定法（DELFIA）中的Ln3+ 螯合物，极大地提高了发光信号，并改善了检测灵敏度。由于在传统的DELBA技术中，Ln3+ -NPs不能直接与抗体连接，Ln3+ -NPs（如Eu3+ -NPs）通常与生物素的羧基（-COOH）配位进而定量标记抗原或抗体，并进行常规的免疫应答，形成免疫复合物。当NPs在增强液中溶解后，NPs中的Eu3+ 被释放到含有配体的胶束中，形成具有荧光发射的铕配合物。然而，据我们所知，Eu3+ 与PO4 3- 结合能力高于Eu3+ 与-COOH结合能力，稳定常数KEuPO4 >KEu(COOH)3 ，在检测过程中所用PBST洗涤缓冲液和血清样本中存在的PO4 3- 可能导致Eu3+ 与-COOH配位连接不稳定，因此，需要一种更稳定的连接方式来确保检测结果的准确性。 介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）具有独特的介孔结构、良好的单分散性以及表面易功能化等特点，是一种极具应用前景的框架材料。近年来，表面多种基团修饰的介孔二氧化硅纳米粒子被广泛用于多功能纳米材料的制备，在药物的负载和传递方面也显示出巨大潜力。它还可以与量子点、镧系纳米粒子、贵金属纳米团簇等结合形成纳米复合物用于体内外检测和成像。 我们利用树枝状的单分散介孔二氧化硅作为支架，与碱式碳酸铕（Eu(OH)CO3 ）纳米材料结合，形成纳米复合材料MSNs@Eu(OH)CO3 ，用作纳米探针，检测肿瘤标志物。我们首先合成了氨基（-NH2 ）功能化的介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs-NH2 ）作为支架，表面的-NH2 用来与生物素共价连接，进而稳定连接抗体，确保检测结果的准确性。Eu(OH)CO3 纳米材料作为Eu3+ 源，用于溶解提供Eu 3+ 。MSNs-NH2 具有中心辐射的大孔径，大量的Eu(OH)CO3 可以负载到其孔道中，形成纳米复合结构MSNs@Eu(OH)CO3 。在酸性余辉增强液中溶解后，高浓度的Eu3+ 被释放出来，进入到胶束中，并转化为Eu(β-NTA)3 (TOPO)2 配合物。配合物作为发射体，与SiPc[OSi(n-C6 H13 )3 ]2 （光敏剂）和PCU-1（光能缓存单元）构成光化学长余辉体系，以余辉信号作为检出信号，可以消除复杂样品中自发荧光和光散射影响。 我们设计的MSNs@Eu(OH)CO3 纳米复合材料具有“一石二鸟”的作用：（1）复合材料的-NH2 可以通过共价键与生物素稳定连接，进而连接检测抗体，确保检测结果的准确性。（2）负载高浓度的Eu3+ ，在余辉增强液中溶解后，增强余辉发光信号作为检测信号，提高了检测灵敏度。 我们开发了一种独特的基于MSNs@Eu(OH)CO3 的具有“一石二鸟”功能的纳米探针。这种纳米探针表面存在较高浓度-NH2 ，能够与生物素通过共价键稳定连接，进而连接抗体，确保了检测结果的准确性。而且纳米探针负载了高浓度的Eu(OH)CO3 ，在酸性余辉增强液的作用下，能够在2 min内快速溶解释放大量Eu3+ 形成Eu(β-NTA)3 (TOPO)2 配合物作为发射体构成光化学长余辉体系，余辉信号作为检测信号能够定量检测血清样本中的AFP水平，避免了血清样本自发荧光干扰，检测限低至0.12 ng/mL。另外，我们利用MSNs@Eu(OH)CO3 纳米探针对20例临床血清样本进行了检测，检测结果可靠，检测灵敏度高，与临床CLIA的相关系数为0.99。这种基于MSNs@Eu(OH)CO3 纳米探针和余辉检测系统，不仅丰富了光化学长余辉的应用领域，而且为生物检测提供了一种新的平台。 作者首先合成了带有氨基（-NH2 ）的介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs-NH2 ）和负载Eu(OH)CO3 的纳米复合材料MSNs@Eu(OH)CO3 ，并分别对其进行了表征，确认了两种纳米材料的结构。
作者对合成纳米复合材料过程中的MSNs-NH2 的用量进行了优化，制备了表面含有不同-NH2 浓度和负载不同Eu3+ 浓度的MSNs@Eu(OH)CO3 ，并与SiO2 @Eu(OH)CO3 中的-NH2 浓度和Eu3+ 浓度进行了对比。
作者将纳米复合材料溶解于余辉增强液中，纳米复合材料在酸性增强液中溶出Eu3+ ，并与配体形成Eu(β-NTA)3 (TOPO)2 配合物，并进一步与SiPc（敏化剂）、PCU-1（光能缓存单元）构成光化学余辉体系，在680 nm激光器激发后，发出红色余辉光。
为了后续构建检测体系，作者将纳米复合材料MSNs@Eu(OH)CO3 共价连接了生物素，评价了连接生物素的稳定性，并与NaEuF4 NPs通过配位方式连接生物素的稳定性进行了对比。
作者以MSNs@Eu(OH)CO3 为纳米探针，用于溶解增强余辉发光生物检测，以甲胎蛋白（AFP）作为模型检测物实现了超灵敏检测，检测限低至0.12 ng/mL。接下来利用该方法对20例临床血清样本进行了检测，检测结果可靠，检测灵敏度高，与临床CLIA结果的相关系数为0.99。
李富友教授 ，博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者。主要从事生物医用发光材料相关的研究，涉及有机荧光染料、磷光配合物、稀土发光材料、上转换发光材料等的合成及其在生物医学方面的应用和转化。承担科技部纳米科技重点专项项目、973项目子课题、自然科学基金重大仪器专项、重点项目等多项国家重大课题的研究。在Nat. Photonics, Nat. Protoc., Nat. Commun., Chem. Rev., Chem. Soc. Rev., J. Am. Chem. Soc. 等杂志上发表SCI论文200余篇，连续多年入选Thomson Reuters（汤森路透）公布的全球“Highly cited Researchers”（高引用科学家）名录。 F. Zhang, D. Hu, X. Su, et al. Two birds with one stone: Amine-functionalized MSNs@Eu(OH)CO3 nanoprobe for efficient dissolution-enhanced afterglow bioassay. Nano Research . https://doi.org/10.1007/s12274-022-4464-6.
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