化学同位素标记的分子内H-D迁移结合LC-MS用于代谢物的定性分析

液相色谱质谱联用 (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS) 技术由于具有高的检测灵敏度、并可以提供代谢物精准分子质量等信息，是目前非目标代谢组学分析最常用的工具。在过去十年中，虽然LC-MS仪器的准确性、分辨率和分析速度均有所提高，但鉴于代谢物组成的复杂性，代谢物结构识别与鉴定仍然是非目标性组学分析的一个主要挑战。

氢-氘交换 (hydrogen-deuterium exchange, HDX) 是一种氢原子被氘原子取代的化学反应。HDX结合LC-MS (HDX-LC-MS) 技术常用于蛋白组学中蛋白质高级结构的研究，其分析方法主要有两种方式。第一种方式是利用氘代试剂的氘原子取代被分析分子中的活性H原子 (-OH, -COOH, -NH₂, -SH) 实现定性分析，即在氘代试剂的氛围中，样品可以在LC分离过程或是离子源中完成HDX反应。随后，通过比较HDX反应前后目标物的分子质量差，可获得分子结构中的活性 H 原子数信息。然而，将HDX-LC-M策略用于代谢物分子鉴定分析时，由于 HDX 过程的可逆性可能导致分析结果的重现性较差，通常需要D₂O或CD₃OD作为流动相维持相应氘代分子稳定性，这使得分析成本相对较高。HDX-LC-MS的另一种方式是基于目标物本身结构含有活性D原子，当使用串联质谱对其进行分析时，目标物分子在质谱碰撞池内会发生分子内的H与D重排 (hydrogen-deuterium scrambling，HDS) 反应，通过观察多级质谱图，可解析目标物的碎裂路径，从而辅助鉴定目标分子。但这种方式对目标物自身结构要求很高，需要其在结构上含有活性D原子，故而在应用上受到了限制。

最近，武汉大学的冯钰锜教授（点击查看介绍）课题组利用化学同位素标记结合液相色谱高分辨质谱 (Liquid chromatography high resolution mass spectrometry, LC-HRMS) 技术，建立了分子内 H-D 迁移方法，为代谢物的定性分析提供了一种新的辅助手段。他们利用氘代标记化试剂——d₄-4-二甲胺基苯基乙硫氰酸酯 (4-(N,N-Dimethylamino)phenyl isothiocyanate, d₄-DMAP) 标记氨基化合物。标记产物在碰撞诱导裂解下 (collision-induced dissociation, CID) 能产生分子内 H-D 迁移。基于此，他们研究了d₄-DMAP 标记氨基标准品在 CID 中的分子内 H-D 迁移规律，发现该规律可有效反映氨基化合物的分子内活性 H 原子数目。将该方法应用于小鼠粪便中氨基化合物的结构定性可以在很大程度上减少氨基候选物的数目，提高代谢物定性准确性。该思路还可以用于其它代谢物的辅助定性分析。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是武汉大学的郑书剑博士。

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Hydrogen–Deuterium Scrambling Based on Chemical Isotope Labeling Coupled with LC–MS: Application to Amine Metabolite Identification in Untargeted Metabolomics

Shu-Jian Zheng, Jie Zheng, Cai-Feng Xiong, Hua-Ming Xiao, Shi-Jie Liu, Yu-Qi Feng

Anal. Chem., 2020, 92, 2043-2051, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04512

导师介绍

冯钰锜

https://www.x-mol.com/university/faculty/13605