HPLC is established as a fast convenient analytical technology for characterizing the content of empty and full capsids in purified samples containing adeno-associated virus (AAV). UV-based monitoring unfortunately over-estimates the proportion of full capsids and offers little value for characterizing unpurified samples. The present study combines dual-wavelength UV monitoring with intrinsic fluorescence, extrinsic fluorescence, and light-scattering to extend the utility of HPLC for supporting development of therapeutic AAV-based drugs. Applications with anion exchange (AEC), cation exchange (CEC), and size exclusion chromatography (SEC) are presented. Intrinsic fluorescence increases sensitivity of AAV detection over UV and enables more objective estimation of empty and full capsid ratios by comparison of their respective peak areas. Light scattering enables identification of AAV capsids in complex samples, plus semiquantitative estimation of empty and full capsid ratios from relative peak areas of empty and full capsids. Extrinsic Picogreen fluorescence enables semiquantitative tracking of DNA with all HPLC methods at all stages of purification. It does not detect encapsidated DNA but reveals DNA associated principally with the exteriors of empty capsids. It also enables monitoring of host DNA contamination across chromatograms. These enhancements support many opportunities to improve characterization of raw materials and process intermediates, to accelerate process development, provide rapid in-process monitoring, and support process validation.

中文翻译：

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用于快速过程开发，过程中监测以及AAV生产和纯化验证的多显示器HPLC分析

HPLC被确立为一种快速便捷的分析技术，用于表征含有腺相关病毒（AAV）的纯化样品中空壳和全衣壳的含量。不幸的是，基于紫外线的监测高估了衣壳的比例，对表征未纯化的样品几乎没有价值。本研究将双波长UV监测与固有荧光，外部荧光和光散射结合在一起，以扩展HPLC的效用，以支持基于AAV的治疗药物的开发。介绍了阴离子交换（AEC），阳离子交换（CEC）和尺寸排阻色谱（SEC）的应用。内在荧光可以提高AAV检测对紫外线的灵敏度，并可以通过比较各自的峰面积来更客观地估算空壳比和完整衣壳比。光散射可以识别复杂样品中的AAV衣壳，并可以根据空和满衣壳的相对峰面积对空和满衣壳比率进行半定量估计。外在的Picogreen荧光可以在纯化的所有阶段使用所有HPLC方法对DNA进行半定量跟踪。它不检测衣壳化的DNA，但可以揭示主要与空衣壳外部相关的DNA。它还可以跨色谱图监控宿主DNA污染。这些增强功能为改善原材料和过程中间体的特性，加速过程开发，提供快速的过程中监视以及支持过程验证提供了许多机会。加上从空壳和满壳的相对峰面积进行的半壳和空壳比的半定量估计。外在的Picogreen荧光可以在纯化的所有阶段使用所有HPLC方法对DNA进行半定量跟踪。它不检测衣壳化的DNA，但可以揭示主要与空衣壳外部相关的DNA。它还可以跨色谱图监控宿主DNA污染。这些增强功能为改善原材料和过程中间体的特性，加速过程开发，提供快速的过程中监视以及支持过程验证提供了许多机会。加上从空壳和满壳的相对峰面积进行的半壳和空壳比的半定量估计。外在的Picogreen荧光可以在纯化的所有阶段使用所有HPLC方法对DNA进行半定量跟踪。它不检测衣壳化的DNA，但可以揭示主要与空衣壳外部相关的DNA。它还可以跨色谱图监控宿主DNA污染。这些增强功能为改善原材料和过程中间体的特性，加速过程开发，提供快速的过程中监视以及支持过程验证提供了许多机会。它不检测衣壳化的DNA，但可以揭示主要与空衣壳外部相关的DNA。它还可以跨色谱图监控宿主DNA污染。这些增强功能为改善原材料和过程中间体的特性，加速过程开发，提供快速的过程中监视以及支持过程验证提供了许多机会。它不检测衣壳化的DNA，但可以揭示主要与空衣壳外部相关的DNA。它还可以跨色谱图监控宿主DNA污染。这些增强功能为改善原材料和过程中间体的特性，加速过程开发，提供快速的过程中监视以及支持过程验证提供了许多机会。