Abstract

Gene targeting is extensively used to generate designer mouse mutants and to study gene function in vivo. Knockout mice that harbor a null allele in their germline provide appropriate genetic models of inherited diseases and often exhibit embryonic or early postnatal lethality. To study gene function in adult mice and in selected cell types, a refined strategy for conditional gene inactivation has been developed that relies on the DNA recombinase Cre and its recognition (loxP) sites. This process has traditionally relied on the complex process involving genome editing in embryonic stem (ES) cells despite its limitations, including incorrect targeting or cassette structure, and difficulties with germline transmission of the allele from chimeric mice. CRISPR-Cas9 gene editing technology has considerably facilitated the generation of mouse knockout alleles, relieving many of the cumbersome and time-consuming steps of traditional mouse ES cell technology. However, the generation of conditional knockout alleles remains an important challenge. An earlier study reported up to 16% efficiency in generating conditional knockout alleles in mice using 2 single guide RNAs (sgRNA) and 2 single-stranded oligonucleotides (ssODN), which has been questioned by another report combining data from multiple transgenic cores. With the advent of CRISPR/Cas9 as a mouse genome modification tool, we assessed the efficiency of using this method in creating conditional targeted alleles in three genes, phosphatase and actin regulator 1 (Phactr1), apolipoprotein A-I (ApoA1), and actin-related protein T2 (Actrt2). Even though overall success rate was low—about 2.5%—we show that it’s possible to reliably generate conditional knockout alleles using CRISPR/Cas9 on a consistent basis.

中文翻译：

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使用两个向导/两个寡核苷酸方法通过CRISPR / Cas9介导的基因组编辑来稳定产生带有条件敲除等位基因的小鼠

摘要

基因靶向被广泛用于产生设计小鼠突变体和研究体内基因功能。在种系中具有无效等位基因的敲除小鼠提供了遗传疾病的适当遗传模型，并且通常表现出胚胎或出生后早期的致死性。为了研究成年小鼠和选定细胞类型中的基因功能，已经开发了一种有条件的基因失活的改进策略，该策略依赖于DNA重组酶Cre及其识别（loxP）位点。尽管有局限性，包括不正确的靶向或盒结构，以及来自嵌合小鼠的等位基因的种系传递困难，但该过程历来依赖复杂的过程，涉及胚胎干（ES）细胞中的基因组编辑。CRISPR-Cas9基因编辑技术极大地促进了小鼠敲除等位基因的产生，从而减轻了传统小鼠ES细胞技术的许多繁琐且耗时的步骤。然而，条件敲除等位基因的产生仍然是重要的挑战。较早的一项研究报道，使用2个单向导RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸（ssODN）在小鼠中产生条件性敲除等位基因的效率高达16％，另一项结合了多个转基因核心数据的报告对此提出质疑。随着CRISPR / Cas9作为小鼠基因组修饰工具的出现，我们评估了使用这种方法在三个基因（磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（Phactr1），载脂蛋白AI（ApoA1）和肌动蛋白相关）中创建条件靶向等位基因的效率蛋白质T2（Actrt2）。即使总体成功率很低（约2.5％），我们也证明可以始终如一地使用CRISPR / Cas9可靠地产生条件敲除等位基因。条件敲除等位基因的产生仍然是一个重要的挑战。较早的一项研究报道，使用2个单向导RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸（ssODN）在小鼠中产生条件性敲除等位基因的效率高达16％，另一项结合了多个转基因核心数据的报告对此提出质疑。随着CRISPR / Cas9作为小鼠基因组修饰工具的出现，我们评估了使用这种方法在三个基因（磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（Phactr1），载脂蛋白AI（ApoA1）和肌动蛋白相关）中创建条件靶向等位基因的效率蛋白质T2（Actrt2）。即使总体成功率很低（约2.5％），我们也证明可以始终如一地使用CRISPR / Cas9可靠地产生条件敲除等位基因。条件敲除等位基因的产生仍然是一个重要的挑战。较早的一项研究报道，使用2个单向导RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸（ssODN）在小鼠中产生条件性敲除等位基因的效率高达16％，另一项结合了多个转基因核心数据的报告对此提出质疑。随着CRISPR / Cas9作为小鼠基因组修饰工具的出现，我们评估了使用这种方法在三个基因（磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（Phactr1），载脂蛋白AI（ApoA1）和肌动蛋白相关）中创建条件靶向等位基因的效率蛋白质T2（Actrt2）。即使总体成功率很低（约2.5％），我们也证明可以始终如一地使用CRISPR / Cas9可靠地产生条件敲除等位基因。较早的一项研究报道，使用2个单向导RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸（ssODN）在小鼠中产生条件性敲除等位基因的效率高达16％，另一项结合了多个转基因核心数据的报告对此提出质疑。随着CRISPR / Cas9作为小鼠基因组修饰工具的出现，我们评估了使用这种方法在三个基因（磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（Phactr1），载脂蛋白AI（ApoA1）和肌动蛋白相关）中创建条件靶向等位基因的效率蛋白质T2（Actrt2）。即使总体成功率很低（约2.5％），我们也证明可以始终如一地使用CRISPR / Cas9可靠地产生条件敲除等位基因。较早的一项研究报道，使用2个单向导RNA（sgRNA）和2个单链寡核苷酸（ssODN）在小鼠中产生条件性敲除等位基因的效率高达16％，另一项结合了多个转基因核心数据的报告对此提出质疑。随着CRISPR / Cas9作为小鼠基因组修饰工具的出现，我们评估了使用这种方法在三个基因（磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（Phactr1），载脂蛋白AI（ApoA1）和肌动蛋白相关）中创建条件靶向等位基因的效率蛋白质T2（Actrt2）。即使总体成功率很低（约2.5％），我们也证明可以始终如一地使用CRISPR / Cas9可靠地产生条件敲除等位基因。