Objective To develop a new technique for improved cell surface protein detection and analysis by combining chemical labeling with mild cell lysis using model HCT 116 colorectal cancer cells. Results We found that Dounce homogenization by hand, rather than the typical sonication or syringe lysis method, recovered surface/membrane proteins more consistently and effectively. This was indicated by marker membrane proteins such as claudin-4 and EGFR (epidermal growth factor receptor) that span the typical 20–200 kD range. As monitored by Western blotting (WB), the Dounce lysis method combined with cell surface biotinylation showed consistent recovery of the marker proteins claudin-4 and EGFR. This lysis method was combined with a cell surface biotinylation strategy to enrich cell surface/membrane proteins using affinity bead-based purification with four-fold less cells compared to prior work. Subsequent LC/MS/MS analysis identified 49 additional surface/membrane proteins for the first time from HCT 116 cells. Conclusion This combination of methodologies may fit into an advanced workflow for identifying new and elusive cell surface proteins. It can increase the protein coverage for biomarker discovery for colorectal cancer or other cancers. This new detection/analysis approach may also promote new applications in surface display systems as well as cell screening, selection, and binding processes.

中文翻译：

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通过在结直肠癌细胞模型中将化学标记与机械裂解相结合，提高细胞表面蛋白检测的灵敏度

目的利用模型HCT 116结直肠癌细胞，通过将化学标记与温和细胞裂解相结合，开发一种改进细胞表面蛋白检测和分析的新技术。结果 我们发现，与典型的超声处理或注射器裂解方法相比，Dounce 手动匀浆更一致、更有效地回收表面/膜蛋白。这由跨越典型 20-200 kD 范围的标记膜蛋白如 claudin-4 和 EGFR（表皮生长因子受体）表明。正如蛋白质印迹 (WB) 所监测的那样，结合细胞表面生物素化的 Dounce 裂解方法显示出标记蛋白 claudin-4 和 EGFR 的一致恢复。这种裂解方法与细胞表面生物素化策略相结合，使用基于亲和珠的纯化来富集细胞表面/膜蛋白，与之前的工作相比，细胞减少了四倍。随后的 LC/MS/MS 分析首次从 HCT 116 细胞中鉴定了 49 种额外的表面/膜蛋白。结论 这种方法的组合可能适合用于鉴定新的和难以捉摸的细胞表面蛋白的高级工作流程。它可以增加用于结肠直肠癌或其他癌症生物标志物发现的蛋白质覆盖率。这种新的检测/分析方法也可能促进表面展示系统以及细胞筛选、选择和结合过程的新应用。随后的 LC/MS/MS 分析首次从 HCT 116 细胞中鉴定了 49 种额外的表面/膜蛋白。结论 这种方法的组合可能适合用于鉴定新的和难以捉摸的细胞表面蛋白的高级工作流程。它可以增加用于结肠直肠癌或其他癌症生物标志物发现的蛋白质覆盖率。这种新的检测/分析方法也可能促进表面展示系统以及细胞筛选、选择和结合过程的新应用。随后的 LC/MS/MS 分析首次从 HCT 116 细胞中鉴定了 49 种额外的表面/膜蛋白。结论 这种方法的组合可能适合用于鉴定新的和难以捉摸的细胞表面蛋白的高级工作流程。它可以增加用于结肠直肠癌或其他癌症生物标志物发现的蛋白质覆盖率。这种新的检测/分析方法也可能促进表面展示系统以及细胞筛选、选择和结合过程的新应用。