中国学者培育出基因编辑抗寒瘦肉猪丨特别关注

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BioArt按：中国是猪肉消费大国，生猪饲养量和猪肉消费量均占世界总量的一半左右。为了获得更高品质的猪肉和节约更多的生猪养殖饲料，通过基因编辑技术针对影响猪重要经济性状的主效基因进行遗传修饰，对于满足消费者对于高品质猪肉的需求以及促进中国生猪产业的健康发展具有重要意义。10月23日，中科院动物研究所赵建国研究员与金万洙研究员以及中国农业科学院北京畜牧兽医研究所王彦芳研究员合作在PNAS杂志上以长文形式（PNAS PLUS）发表了题为“Reconstitution of UCP1 using CRISPR/Cas9 in the white adipose tissue of pigs decreases fat deposition and improves thermogenic capacity”的研究论文，利用CRISPR/Cas9介导的非同源重组整合外源片段的方式，构建了UCP1基因定点（猪内源UCP1假基因位点）敲入猪，实现了UCP1基因在猪白色脂肪组织的特异表达。揭示了UCP1基因对猪脂肪代谢的影响机制，发现UCP1在猪的白色脂肪中表达，可以减少脂肪沉积，从而增加瘦肉率，同时提高猪的抗寒能力，为猪的新品种培育提供了良好的素材，也为通过基因编辑技术改良猪的数量性状提供了概念验证。相关成果在线后还受到了包括新华网、Science杂志等国内外媒体的关注。

论文解读：

在我国，猪肉的消费和生产占有特别重要的地位，生猪饲养量和猪肉消费量均占世界总量的一半左右，2015年中国生猪出栏7亿多头。根据《全国生猪生产发展规划（2016-2020年）》数据显示，育肥猪料肉比降低0.1，全国可以节约600万吨饲料。因此通过基因编辑技术针对影响猪重要经济性状的主效基因进行遗传修饰，可以快速降低猪的脂肪沉积、提高瘦肉率和生产效率，不但能够增加养猪生产的经济效益，还可以满足消费者对于高品质猪肉的需求，促进中国生猪产业的健康发展。

哺乳动物主要存在两种脂肪：储存能量的白色脂肪和消耗能量的棕色脂肪。很多研究表明，棕色脂肪可以通过消耗能量来维持体温和抵抗肥胖【1】。而解偶联蛋白1（UCP1，Uncoupling protein 1）是棕色脂肪产热和代谢调节系统的必要条件和关键组分。

然而在进化过程中，现代家猪的祖先在2000万年前就丢失了UCP1基因， 因而也缺少棕色脂肪。这可能是新生仔猪对寒冷环境极其敏感的原因之一。仔猪因寒冷应激造成的死亡，不仅影响了动物福利，更是给寒冷地区的畜牧生产带来了巨大的经济损失。更为重要的是，UCP1的缺失可能和猪易于沉积脂肪也与有关。脂肪的过度沉积会降低饲料报酬，增加生产成本，同时食用高脂肪含量的猪肉也不利于人类健康。

中科院动物研究所赵建国研究员与金万洙研究员以及中国农业科学院北京畜牧兽医研究所王彦芳研究员在前期的合作中发现了抗寒品种猪（藏猪、东北民猪）抵御寒冷应激的分子机制，揭示了UCP3基因 （UCP家族成员）与白色脂肪棕色化对猪能量代谢的重要影响【2】。

在上述研究基础上，该科研团队进一步利用CRISPR/Cas9介导的非同源重组整合外源片段的方式，构建了UCP1基因定点（猪内源UCP1假基因位点）敲入猪，实现了UCP1基因在猪白色脂肪组织的特异表达（下图）。试验结果表明，UCP1猪在急性冷刺激情况下的体温维持能力显著优于野生型猪，能更好的抵抗寒冷环境。生产性能测定结果显示UCP1转基因猪脂肪率显著降低（减少4.89%），背膘厚度显著降低（减少2.4mm），瘦肉率显著增加（增加3.38%）。

(A-C) UCP1定点敲入（KI）猪的获得及鉴定。(D-E) UCP1在猪白色脂肪中表达提高仔猪的体温调节能力。(F-G) UCP1定点敲入猪胴体脂肪率显著降低，背膘减少，瘦肉率显著上调。

进一步对转基因猪进行活动量和代谢率测定，结果表明在正常状态下，UCP1在猪白色脂肪中的表达对猪的生理活动及能量代谢无影响。分子机制解析发现UCP1基因通过促进脂肪水解从而使脂肪沉积减少。

上述工作确认了猪的内源UCP1基因的缺失，揭示了UCP1基因对猪脂肪代谢的影响机制，发现UCP1在猪的白色脂肪中表达，可以减少脂肪沉积，从而增加瘦肉率，同时提高猪的抗寒能力，为猪的新品种培育提供了良好的素材，也为通过基因编辑技术改良猪的数量性状提供了概念验证。

据悉，中科院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室博士生郑千涛、博士后黄娇娇博士和动物生态与保护生物学重点实验室博士生林骏为共同第一作者, 中国科学院动物研究所赵建国研究员、金万洙研究员和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所王彦芳研究员为共同通讯作者。该课题得到了中国科学院战略性先导科技专项、国家转基因专项、国家自然科学基金、国家基础研究计划和863计划等项目的资助。

值得一提的的是该工作发表后，受到了新华社、美国国家公共电台（NPR）和Science等知名媒体或杂志的关注。NPR在题为“CRISPR Bacon: Chinese Scientists Create Genetically Modified Low-Fat Pigs”的文章中引述密苏里大学Michael Roberts教授（注：这篇PNAS论文的editor，美国科学院院士）评论，该评论谈到“这篇论文在技术上十分重要，在提升这些猪肉产量的同时还提供了一种改善动物福利的方式”（"This is a paper that is technologically quite important"， "It demonstrates a way that you can improve the welfare of animals at the same as also improving the product from those animals — the meat"。）。Roberts教授对这种基因修饰猪是否能够被美国FDA批准上市还抱有疑虑，当然也不确定美国人今后是否会食用这种猪肉（"I very much doubt that this particular pig will ever be imported into the USA — one thing — and secondly, whether it would ever be allowed to enter the food chain"）。

据了解，这是最近几个月来赵建国实验室及其合作者在猪遗传学领域发表的第三篇重要成果。早在今年6月份，eLife杂志发表了一篇由“中国猪化学诱变联盟”完成的题为“A pilot study of large-scale production of mutant pigs by ENU mutagenesis”的重要研究成果。在孟安明院士和周琪院士的倡导下，中科院动物研究所孟安明院士、周琪院士、赵建国研究员和王红梅研究员团队联合第三军医大学魏泓教授团队、东北农业大学刘忠华教授团队、解放军总医院杨仕明研究员团队、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所李奎研究员、杨述林研究员团队、南方医科大学顾为望教授团队成立了“中国猪化学诱变联盟”，成功建立了猪的化学诱变体系，开展了大规模的猪ENU化学诱变和突变体筛选研究。首先成功建立了广西巴马猪的化学诱变体系，通过三代遗传家系的组建来筛选显性突变体和隐性突变体。成功获得36个显性遗传突变体和91个隐性遗传突变体，建立了多个能准确模拟人类疾病的大动物模型和可用于猪新品系培育的育种新材料（下图）。

通过化学诱变筛选到大量的突变体

9月22日，Blood杂志发表了中科院动物研究所赵建国研究员、刘峰研究员和第三军医大学魏泓教授合作的题为“Thyroid hormone regulates hematopoiesis via TR-KLF9”的研究成果，该研究在前述利用ENU化学诱变技术高效地创制了大量的猪疾病模型和突变体中，发现了一例先天性无毛突变体隐性遗传的家系。通过表型分析发现该突变体表现为与人类接近的严重甲减特征。基于家系的全基因组连锁分析和全基因组测序成功定位了致病基因DUOX2。同时利用CRISPR/Cas9系统在正常猪中敲除该基因相应的区域，发现突变体表型与ENU诱变获得的表型一致，进一步证实了DUOX2为该家系的致病基因。该工作创制了首例猪甲减模型，并首次发现KLF9作为一个关键的因子介导甲状腺激素受体调控造血和免疫细胞的发生（下图），从而揭示了甲减患者贫血和免疫缺陷的潜在原因，为人类甲减的精准医疗研究提供理论支撑；同时也为培育高免疫力的新品系猪和猪的健康养殖提供了理论基础。

甲状腺激素通过TR-KLF9轴影响红细胞和淋巴细胞生成的模式图

参考文献：

1、Wang, W., & Seale, P. (2016). Control of brown and beige fat development.Nature Reviews Molecular Cell Biology,17(11), 691-702.

2、Lin, J., Cao, C., Tao, C., Ye, R., Dong, M., Zheng, Q., ... & Li, K. (2017). Cold adaptation in pigs depends on UCP3 in beige adipocytes.Journal of Molecular Cell Biology,1-12.