糖基化修饰是细胞中最普遍也最复杂的翻译后修饰之一，其中N-糖基化不仅调控蛋白质折叠、定位与稳定性，还参与信号转导、免疫应答、病毒识别等关键生命过程。然而，当前N-糖基化组学水平的研究主要集中在“有无修饰”或“修饰多少”等的丰度及组成变化注释层面，对于“哪些糖基化修饰位点真正发挥生物学功能”以及“哪些位点参与调控重要表型”等仍缺乏系统性的鉴定策略。

为实现糖基化位点的系统性功能解码，复旦大学化学系/生物医学研究院/卫健委糖复合物重点实验室陆豪杰/张莹团队提出了一种全新的功能性N-糖基化位点挖掘的化学蛋白质组学策略——Glyco-dependent thermal shift profiling (GTSP)，通过热稳定性变化与糖基位点精准鉴定相结合，在系统层面实现了功能性糖基化位点的高通量、高特异挖掘。

首先，为了能够对低丰度糖基化修饰影响的蛋白质稳定性进行研究，团队针对传统热蛋白质组学方法（TPP）在灵敏度和通量方面进行了全面提升。传统TPP方法通过绘制蛋白质在不同温度下的溶解曲线，推算其半数变性温度（Tm），用于反映蛋白稳定性。但这种方法需要大量样本和多达10个温度点的数据，实验成本高，通量低，不适合于研究低丰度修饰蛋白质。为解决这一问题，作者通过理论计算将整个流程精简为两个关键温度区间（37–41°C与47–63°C），提出新的热稳定性参数Rm，仅通过两标定量试剂TMT的标记即可完成。模型数据验证显示，Rm与传统Tm高度相关，并在检测代谢物NADPH和药物panobinostat作用下的蛋白稳定性变化中表现出更高的灵敏度和一致性，且将检测通量提升了5倍。在此基础上，作者进一步将其与N-糖基化蛋白质富集技术相结合开发了GTSP方法，分别计算全蛋白质组与N-糖修饰肽段的Rm值差异，从而判断特定位点的糖基化是否对蛋白质热稳定性产生显著影响。

该方法在HEK293T细胞中识别出数百个功能性N-糖基化位点能够显著提高蛋白的热稳定性，报道了目前第一个系统性的功能糖基化位点的数据集。研究进一步对多个具有代表性的蛋白质糖基化位点进行了功能验证。例如，膜蛋白Ephrin-B2在两个N-糖基化位点突变（N36Q和N139Q）后，蛋白稳定性下降，细胞膜定位能力受损；酶蛋白NEU1，其高度保守的N352糖基化位点突变后，酶活性大幅下降，说明糖基化在维持其催化活性中的关键作用。此外，作者还系统分析了糖基化位点的结构特征，发现多数功能性糖基化位点更倾向于分布在loop区域、结构有序且溶剂暴露区域，提示其对蛋白结构的稳定具有特定偏好。

该研究不仅为功能性N-糖基化的发现提供了全新的研究策略，也为其他修饰的功能注释提供了新的技术。如，通过和不同的富集方法结合，GTSP策略可拓展至其他修饰类型（磷酸化、泛素化等）的功能位点挖掘，并可应用于靶点筛选、疾病标志物发现等多个方向，有望成为修饰蛋白质功能研究提供重要工具。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，复旦大学博士研究生王国力和马诗韵为论文共同第一作者，陆豪杰和张莹两位教授为论文通讯作者。

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A Chemoproteomic Approach for System-Wide and Site-Specific Uncovering of Functional Protein N-Glycosylation

Guoli Wang, Shiyun Ma, Haoru Song, Yuying Liang, Xinze Li, Lei Zhang, Haojie Lu*, Ying Zhang*

J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c08065

导师介绍

陆豪杰

https://www.x-mol.com/university/faculty/9645