LAMP-MS用于超低起始量DNA 5mC与RNA m⁶A可视化单碱基定量检测

结直肠癌（CRC）在全球范围内的发病率和死亡率均居高不下，对公共健康构成了重大威胁。血液中循环游离DNA（cfDNA）的检测为早期CRC诊断提供了一种有前景的途径。然而，现有的高通量测序技术因其复杂性和耗时性，限制了其在临床上的广泛应用。因此，亟需开发一种经济高效、高分辨率的cfDNA定量检测方法。

近日，复旦大学胡璐璐研究员团队与复旦大学华山医院消化科刘杰教授、美国芝加哥大学何川教授合作，设计了一种结合线性扩增与单碱基定量核酸质谱的新型技术（LAMP-MS）。该技术能够对低至1 ng的血浆cfDNA进行无偏倚扩增，实现多个cfDNA甲基化位点的高分辨率可视化检测。LAMP-MS为CRC的早期筛查提供了一种经济高效且可视化的方法，具有降低CRC相关发病率和死亡率的巨大潜力。除此之外，研究团队还通过整合GLORI与质谱技术，实现了对RNA m⁶A修饰的定量检测，拓展了质谱技术在低起始量样本中RNA修饰检测的应用前景。

LAMP-MS用于cfDNA甲基化定量的工作流程包括以下步骤：cfDNA提取、接头连接、亚硫酸氢盐转换、线性扩增、特异性片段PCR、单碱基延伸和质谱检测。首先，从患者血浆中提取的cfDNA样品（1 ng）进行末端修复，并与含有甲基化双链T7启动子的DNA接头连接。随后，进行亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶（dC）转换为尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变。接着，利用T7 RNA聚合酶进行无偏倚线性扩增，生成微克级别的RNA产物，并通过逆转录生成微克级别的cDNA。然后，对包含特定DNA甲基化位点的序列进行特异性PCR扩增，并利用位点特异性引物进行单碱基延伸。最终，通过核酸质谱检测，质谱峰图揭示了甲基化状态，其中ddATP代表未甲基化的C，ddGTP代表甲基化的5mC。

此外，该研究还开发了基于GLORI技术的单碱基m⁶A可视化核酸质谱定量方法。与以往依赖放射性标记或偏重于定性检测的技术不同，这种新方法提供了一种经济高效且能够在单核苷酸分辨率下精确量化m⁶A位点的手段。值得注意的是，该技术不仅适用于m⁶A，还可广泛应用于其他RNA修饰，如m¹A、m⁵C和假尿苷（Ψ）等。

该研究成果的发表，为临床早期癌症筛查和RNA修饰检测提供了新的技术手段，具有重要的应用价值和前景。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是复旦大学谢润玉（实验室科研助理）、杨晓彤（复旦大学附属肿瘤医院已出站博士后）、何维志（复旦大学附属肿瘤医院助理研究员）。

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LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m⁶A Using Ultra-Low Input

Runyu Xie, Xiaotong Yang, Weizhi He, Zhongguang Luo, Wenshuai Li, Chu Xu, Xiaolong Cui, Ning Wei, Xiaolan Wang, Yixiang Shi, Chuan He, Jie Liu, Wei Zhang, Lulu Hu

Angew. Chem. Int. Ed. 2024, DOI:10.1002/anie.202413872

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胡璐璐

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