JACS：化学酶法添加修饰，提升DNA催化活性

【摘要】

南京大学于涵洋课题组与梁勇课题组合作，开发了用化学酶法在DNA上定点修饰官能团的新技术，展示了该方法在提升DNA的催化活性方面的应用。该文章以Chemoenzymatic installation of site-specific chemical groups on DNA enhances catalytic activity为题，发表在J. Am. Chem. Soc期刊上。

图1 化学酶法加修饰，提升DNA酶活性

【背景】

DNA能够折叠形成具有催化活性的三维结构^1-3，在生物传感等领域具有广泛的应用^4-7。跟基于蛋白质的酶相比，DNA酶（亦称：脱氧核酶）的催化活性较低，原因之一是DNA的化学官能团种类较少。研究者们通过引入化学修饰的方法，提升脱氧核酶的催化性能^8,9；甚至使用体外筛选的技术，直接鉴定具有催化活性的非天然核酶^10-12。

在DNA中引入化学修饰通常依赖于固相合成，需要制备含有目标官能团的亚磷酰胺单体。因此，作者尝试开发一种在DNA特定位点引入化学官能团的合成后修饰新方法，并使用该方法寻找具有更高催化活性的DNA酶。    

【研究内容】

首先，作者设计了使用化学酶法在DNA特定位点引入化学修饰的新策略：先通过糖苷酶特异性切除非经典碱基，产生缺碱基位点；裸露出的醛基与氧胺化合物发生缩合反应，从而引入多种官能团修饰（图2）。

图2 使用化学酶法在DNA中定点引入多种官能团  

在成功建立了化学酶法引入修饰的新策略后，作者尝试将上述不同性质的官能团引入到DNA酶10-23催化核心的不同位点，分析官能团修饰对催化活性的影响。结果表明，在8号位引入羧基（T8Ca）、在12号位引入苯环（A12Bn）有效提升了DNA酶的催化活性。作者通过组合使用两种非典型碱基-糖苷酶对，在一个DNA酶分子的8和12号位分别引入羧基和苯环，该双修饰DNA酶（CaBn）的催化活性比野生型提升了近700倍（图3）。         

图3 化学修饰提升DNA酶的催化活性。    

作者发现DNA酶CaBn对镁离子具有更强的响应性。因此，作者构建了基于CaBn的生物传感器，用于细胞内镁离子成像。在HeLa细胞中，CaBn传感器的平均荧光强度比野生型高约1.6倍。该结果表明，引入官能团修饰有效提升了DNA酶检测金属离子的灵敏度（图4）。

图4 双修饰的DNA酶CaBn响应更低浓度的镁离子，可用于胞内镁离子成像。

随后，作者通过分子动力学模拟，探讨了CaBn响应镁离子的机制。先前的结构解析表明，DNA酶10-23的催化构象中存在三个金属离子结合位点³。作者发现，在引入CaBn修饰后，金属离子结合位点2的镁离子分布概率增加，并且和RNA切割位点的距离变近，暗示了CaBn具有更强的镁离子招募能力，比野生型更容易折叠形成活性的催化构象（图5）。

图5 DNA酶CaBn具有更强的招募镁离子的能力。

最后，作者尝试将该方法扩展到其他DNA酶上。作者发现，使用该化学酶法，既能够提升催化RNA切割反应的DNA酶（8-17）的催化活性，又能够提升具有RNA连接酶活性的DNA酶（9DB1）的催化活性（图6）。    

图6 化学酶法提升其他DNA酶的催化活性。

【总结】

总之，该工作开发了在DNA上引入化学修饰的新方法，鉴定了具有更高催化活性的DNA酶。

【作者信息】

文章的第一作者是张泽、魏婉清和陈思琪，文章的通讯作者是于涵洋教授和梁勇教授，杨锦滔、宋东帆、陈颖涵、赵泽润、陈佳雯、王富龙、王家欢和李喆教授对该工作亦有贡献。

【致谢】

这项工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、江苏省自然科学基金委、中央高校基本科研业务费的支持。

【原文链接】

https://doi.org/10.1021/jacs.4c00484 

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