Nature子刊：口服环肽药物的从头开发

环肽在多肽药物的开发中扮演了越来越重要的角色，在2023年获批的六款多肽和拟肽类的新药中，环肽就占据了三席（Rezafungin、motixafortide、zilucoplan，图1），这足以证明环肽在多肽新药开发中的关键地位。

图1. 2023年FDA批准的三款环肽新药。

然而，与其他多数生物制剂一样，大多数环肽不能口服给药，这是因为口服之后它们在胃肠道中会被快速消化，吸收表现也不太好，这大大阻碍了环肽药物的开发。不过，相对于直链肽，环肽在口服制剂开发方面更具潜力。作为为数不多的口服多肽药物代表，Cyclosporin A、Voclosporin和desmopressin都是环肽（图2）。

图2. 上市口服多肽药物化学结构。

开发口服多肽药物的关键参数包括分子量、氢键供体 (HBD) 数量和极性表面积 (PSA）。大多数口服肽的分子量低于 700 Da，PSA小于 200 Ų，HBD数量不超过 5。但这并非绝对，例如Cyclosporine A (CsA; 1203 Da)，它具有多个 N-甲基化酰胺键，并且可以调整构象来限制其PSA。环肽的分子内部氢键相互作用对于降低PSA、增加环肽口服生物利用度非常关键。大型环肽化合物库对于设计具有靶点特异性和理想物化性质的环肽药物来说十分重要，但现有的环肽化合物库对于开发口服多肽药物来说仍显不足。通常情况下，这些库中的环肽化合物的分子量过大、极性太大、实验动物口服利用度又非常低，而且氨基酸大多数为天然氨基酸。为了扩展环肽化合物库，近日瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Christian Heinis等研究人员开发了一种基于顺序环化和一锅肽酰化和筛选的组合合成和筛选方法，可以同时关注环肽的活性和渗透性。作为概念验证，他们合成了一个含8,448种环肽的化合物库，并进行了针对疾病靶点凝血酶的筛选。该方法可实现库合成多次迭代循环，并产生具有纳摩尔亲和力、高稳定性和高大鼠口服生物利用度（高达18%）的环肽。这种生产可口服环肽的方法具有通用性，有望推动多肽药物的开发。相关论文发表于Nature Chemical Biology。

图3. 二硫醚环肽的合成及代谢稳定性。

为设计代谢更稳定的环肽，此前的研究者多会在环肽中引入二硫键，而本文作者将二硫键替换成二个硫醚键，并构建环肽化合物库。他们设想了一种两步组合合成策略，其中“m”种随机肽被“n”种连接子环化，得到硫醚环化肽，然后在外周胺上与“o”种羧酸反应酰化，得到“m × n × o”种环肽（图3a）。线性多肽两端的巯基与双亲电连接子之间反应形成环肽的过程高效且清洁，无需纯化即可进行产物筛选，可以比较容易地获得大型环肽化合物库，但硫醚键存在被氧化的风险。故而研究人员首先合成 10 种不同的二硫醚环肽 1-10，并详细评估了代谢稳定性（图3b）。结果发现，这10种环肽的稳定性差异很大，半衰期从11分钟（1）到133分钟（2）不等，其中氧化速率和连接子类型之间没有发现明显的相关性。对于半衰期较短的环肽，检测到质量为 M + 16 和 M + 32 的物质，表明在一个或两个位点发生氧化（图3c）。作为稳定性测定的对照物，研究使用了两种已批准的药物verapamil 和diltiazem（图4），这两种药物都具有相当低的稳定性，人体代谢清除率约为 15 ml min⁻¹ kg⁻¹。对比显示，10种环肽中有9种与verapamil和diltiazem稳定性相似或更稳定，对照物的清除比其中 4 个最稳定环肽快 4 倍以上。也就是说，口服递送时这种硫醚环肽的代谢稳定性应该是可以接受的。

图4. Verapamil和diltiazem化学结构。

为实现环肽化合物库的高通量合成，作者使用了顺序环化和氨基酰化的方法，没有进行中间纯化（图5）。他们发现，所合成的八种直链肽P1-P8的粗品平均纯度为 93%。之后使用不同的双亲电子连接子L1-L4与P1-P8直链肽进行环化反应，所进行的32个反应均实现了高环化率（85%）。羧酸A1-A8与多肽氨基之间的缩合反应进行得也非常顺利，几乎达到了100%的转化率。这说明该方法适用于合成大型且多样的环肽化合物库。

图5. 多肽环化和酰化反应构建化合物库

基于该方法，作者合成了一个含8,448种环肽的化合物库，并筛选凝血酶选择性抑制剂（图6）。这些环肽中的大多数违反了利平斯基五规则，表明尽管环肽尺寸仍然相对较小，但它们与经典小分子药物还是存在很大不同。活性分析发现，8,448种环肽中有 73 个 (0.9%) 抑制凝血酶超过 50%，所有这些活性多肽都含有羧酸 A11 或 A12。在经过重新大规模合成并测试后发现，最佳候选底物是环肽 11，对人α-凝血酶K_i值为82 ± 10 nM。

图6. 8,448环肽化合物库的合成及抗凝血酶筛选。

作者在体外评估了这些环肽与口服利用度有关的关键性质，例如蛋白水解稳定性、膜渗透性和代谢稳定性（图7a）。在这些研究结果的基础上，研究人员优化了环肽的设计，并合成了含168种环肽的化合物库。对于母肽11中，作者保持β-高脯氨酸和氯噻吩基团不变，替换了半胱氨酸、苯丙氨酸和环化连接子（图7b）。结果表明，替换苯丙氨酸大大降低了活性，但半胱氨酸侧链和环化连接子的变化影响并不算明显。用连接子 L1 和 L4 环化的肽比L2 的肽具有更高的渗透性，而含 L4 的肽在活性和渗透性方面表现最佳。接下来，研究人员制备并纯化了环肽 31-37，并评估了它们的体外性质（图7c）。最有效的环肽是 32，它对人和大鼠凝血酶的抑制活性分别为 8.9±2.3 nM 和 1.10±0.41 nM，比其母体化合物 11 提高了 10 倍。7 种被测环肽中的大多数具有较高的蛋白水解稳定性，能够在模拟胃肠液孵育中耐受 8 小时（图7c）。肽 31-37 的清除速度与对照化合物verapamil相似。这些结果说明环肽的抑制活性和被动膜渗透性已经足够好，但代谢稳定性对于体内测试来说还是太低。

图7. 凝血酶抑制剂表征及子库筛选。

环肽 32 的主要降解产物为 +16 和 +32，随着孵育时间的延长而增加，这表明硫醚键上发生氧化并可能形成亚砜。因此，研究人员用全烃连接子来环化肽以取代32中的两个硫醚键（图8）。新的产物中，环肽43活性最高，抑制人类和大鼠凝血酶K_i值分别为50±6 nM和11.1±1.4 nM。所有7七种环肽在 PAMPA 中均表现出高被动膜渗透性。母体化合物 32 与环肽 43 的比较显示，环肽 43 具有最佳的凝血酶抑制活性、抗蛋白水解降解性和高渗透性，以及较高的大鼠口服生物利用度，达到了4.5±2.5%。最后，作者尝试消除43中剩余的氧化位点以进一步提高代谢稳定性及生物利用度（图9）。他们选用了17种羧酸单元，发现所得环肽 45 和 46其K_i 值与母体 43 相似。活性较高的46含有4-氯苯甲酸（A22），抑制人和大鼠凝血酶的K_i值分别为65±5 nM和10.3±0.1 nM。46还表现出高蛋白水解稳定性和膜渗透性，在RLM中的稳定性大约高出43两倍。抑制模式的特异性分析表明，46 选择性地与凝血酶结合，因此是一种竞争性抑制剂。在大鼠实验中，46口服后的C_max为400±120 nM，比肽43高两倍，口服生物利用度为18.4±1.9%，已经接近了对照肽1NMe3。

图8. 由烃类连接子环化的肽（基于肽32）。

图9. 具有改善代谢稳定性和口服生物利用度的环肽。

总体来说，研发人员开发出了一个基于顺序环化和一锅肽酰化和筛选的组合合成和筛选方法，可用于构建环肽化合物库。以体外活性、稳定性和渗透性等数据为基础，可对环肽先导物进行优化，得到了凝血酶抑制剂。这种策略可以扩展到其他环肽口服药物的开发之中，有望推动该领域的快速发展。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

De novo development of small cyclic peptides that are orally bioavailable

Manuel L. Merz, Sevan Habeshian, Bo Li, Jean-Alexandre G. L. David, Alexander L. Nielsen, Xinjian Ji, Khaled Il Khwildy, Maury M. Duany Benitez, Phoukham Phothirath & Christian Heinis 

Nat. Chem. Biol., 2023, DOI: 10.1038/s41589-023-01496-y

（本文由北纬55°供稿）