多尺度模拟揭示膜结合颗粒甲烷单加氧酶中铜中心的价态、配位和催化反应活性

含铜颗粒甲烷单加氧酶（Particulate Methane Monooxygenase, pMMO）在催化甲烷转化为甲醇方面发挥着关键作用，该酶参与甲烷氧化细菌内C1代谢途径的第一步反应，且pMMO在所有甲烷氧化细菌中均广泛表达，使甲烷氧化细菌每年消耗数千万公吨大气甲烷，可有效调控了日趋严峻的温室效应。迄今为止，人们对pMMO结构和催化机理的理解仍非常有限。结构方面，PmoC上存在单铜结合位点（指定为Cu_C），其配体包括Asp129、His133和His146（图1）。Cu_C位点具有高度保守性，位于PmoC亚基的无序区域，是纯化pMMO的催化活性中心。而近年来，研究人员将仿生脂质纳米盘与pMMO组装，成功获得了完整的膜内pMMO结构（Science, 2022, 375, 1287-1291；Nature Catalysis, 2023.）在完整的酶结构中，揭示了结合于脂质纳米盘的pMMO内部存在第四个铜位点（指定为Cu_D，图1），位于PmoC亚基中的保守性残基Asn227、His231和His245负责Cu_D的结合，而它们在纯化的pMMO中完全缺失。

图1. 膜结合pMMO的甲烷氧化中心为Cu_D位点，而非Cu_C位点。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

虽然近年来对pMMO进行了大量的实验和理论计算探索，但是，膜结合型pMMO的保守Cu_C和Cu_D位点的价态和催化功能仍然尚未获得清晰诠释。重要的是，铜的价态将直接影响配位结构，进而对氧活化机制和整个pMMO的催化循环产生非常深远的影响。事实上，纯化pMMO中Cu_C(II)的配位构型具有扭曲（或扁平）四面体的几何形状特征。2021年，王斌举教授课题组曾报道了纯化蛋白中Cu_C(II)介导的氧气活化机制，该过程涉及到了酚类还原剂（如DQH₂）的参与，而H₂O₂是激活O-O键的必要中间体，从而生成对甲烷氧化至关重要的Cu(II)-O^•–活性物种（Nature Catalysis, 2021, 4, 266-273）。然而，脂质纳米盘的重建直接影响了pMMO铜中心的配位和/或价态，这一点通过冷冻电镜结果得以支持。冷冻电镜数据表明单个铜离子可以独占Cu_C或Cu_D位点，然而，目前尚未检测到铜离子同时占据这两个位点的现象。在活性方面，Cu_D位点的铜耗尽后，随后进行的铜离子的重新占据可恢复50%的甲烷氧化活性，这无疑就强调了与Cu_D位点相关的潜在催化活性。

为了从微观尺度阐明膜内天然pMMO的催化反应中心的价态特征和反应活性，厦门大学王斌举教授（点击查看介绍）团队采用了经典的MD、QM/MM MD、QM/MM以及QM计算方法，深入研究了膜结合pMMO所含铜中心，尤其是保守的Cu_C和Cu_D位点的价态和反应活性。研究表明，Cu_C和Cu_D位点倾向于Cu(I)的结合，然而，Cu_C和Cu_D位点不太可能同时被Cu(I)占据。活性方面，在H₂O₂和Cu(II)-O^•–活性物种生成中，Cu_D(I)位点比Cu_C(I)位点更具反应活性，此外，动力学模拟表明天然还原剂泛醇（CoQH₂）可有效与Cu_D(I)位点结合，而在Cu_C(I)位点上结合效果不佳，这就证实了膜结合pMMO的实际活性位点更有可能是Cu_D，而不是Cu_C。本研究旨在为揭示膜结合型pMMO的催化机制提供新视点。

这里，QM/MM MD模拟分别设定Cu_C和Cu_D位点为II价和I价，模拟所得配位结构表明：Cu_C(II)和Cu_D(II)中心配位数为4~5，需H₂O配位维持稳定，然而Cu_C(I)和Cu_D(I)则无H₂O配位，配位数仅为3 （图2和3）。结合实验监测的天然/含膜pMMO的Cu_C和Cu_D的ENDOR信号与冷冻电镜结构，即Cu_C和Cu_D中心均无法与水分子配位，合理判断膜结合的Cu_C和Cu_D倾向于I价，配位原子形成了类似等边三角形的排列，而并非等腰直角三角形。

图2. 基于QM/MM MD模拟推导出C链中Cu_C(II)和Cu_C(I)的配位几何形状以及关键的配位距离。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

图3. 基于QM/MM MD模拟推导出C链中Cu_D(II)和Cu_D(I)的配位几何形状以及关键的配位距离。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

同时，本研究还探讨了Cu(I)在pMMO中的占据对稳定性的影响，并且模拟了Cu_C和Cu_D位点同时被Cu(I)占据的可能性。对于Cu_D位点，铜的结合增强了Cu_D周围残基的稳定性。然而，对于Cu_C位点，铜的结合与否对周围氨基酸的稳定性影响非常小。另外，对两个铜中心同时被Cu(I)占据后蛋白的构象变化进行了模拟，出乎意料地揭示了保守的 Glu228 将延伸到Cu_C位点的配位区域，这是在所有冷冻电镜结果中未能发现的现象。由于Glu228与Cu_C的配位，导致Cu_C和Cu_D之间的空腔被显著压缩（图4），产生了较大的空间位阻效应，导致类似于DQH₂的还原剂分子无法有效结合于催化反应位点。因此，基于QM/MM MD模拟，我们推测Cu_C 和Cu_D位点同时占据Cu(I)的可能性较小。

图4. 通过QM/MM MD合理预测了Cu_C和Cu_D位点同时被Cu(I)占据后，两个位点之间空间的几何变化趋势。其中在Cu_C位点为手动添加的铜离子。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

基于上述揭示的膜内pMMO的Cu_C和Cu_D位点的价态和配位结构特征，作者进一步探究了两个铜中心的反应活性。Cu_C(I)位点活化氧气后需要通过两步氢转移（HAT）过程生成H₂O₂，然而，MD模拟说明在第一步HAT反应后，生成的DQH•中间体的结合构象相当稳定，难以自发通过构象翻转实现对Cu_C(II)−OOH^–的近端O的靠近，基于QM/MM metadynamics，他们合理预测DQH•构象翻转所需的能垒将高达16.1 kcal/mol（¹IC1_CuC→¹TS3_CuC），加上第一步HAT反应吸热4.3 kcal/mol，该步反应总能垒为20.4 kcal/mol。然而，对于Cu_D(I)位点，DQH•中间体在MD过程中表现出自发翻转的倾向，导致OH基团非常容易接近Cu_D(II)−OOH^–的近端O（图5，IC2_CuD）。随后，从DQH•到近端O的HAT可在开壳层单线态下发生，且仅需经历7.2 kcal/mol 的势垒（¹IC2_CuD→¹TS3_CuD），进而生成H₂O₂和Cu_D(I)。基于上述QM/MM计算，并结合pMMO-DQH₂/CoQH₂复合物的MD模拟，我们得出结论，膜结合pMMO中的Cu_D位点是甲烷氧化的活性中心。

图5. 以Cu_D(II)−O₂^•–和DQH₂复合物为起始的两步HAT反应生成Cu_D(I)--H₂O₂的相对能量值（kcal/mol）。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

图6. 基于MD 模拟获得的Cu_C位点和Cu_D位点结合了CoQH₂的代表性构象。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

综上，本研究基于以上多尺度模拟可获得以下重要结论：1) 通过对QM/MM MD模拟的配位结构与冷冻电镜结构之间的详细比较，阐明了在Cu_C和Cu_D位点倾向于Cu(I)的结合，然而，Cu_C和Cu_D位点不太可能同时被Cu(I)占据，因为这会引起保守的Glu228与Cu_C位点的协同配位，进而减少Cu_C和Cu_D之间的空间，使其无法容纳还原剂分子（如DQH₂）。2) QM/MM计算表明，在H₂O₂和Cu(II)-O^•–活性物种生成中，Cu_D(I)位点比Cu_C(I)位点具有更高反应活性。3) 对天然还原剂泛醇（CoQH₂）的对接和MD模拟表明，CoQH₂可有效与Cu_D(I)位点结合，而在Cu_C(I)位点上结合效果不佳，这就证实了膜结合pMMO的实际活性位点更有可能是Cu_D，而不是Cu_C。本研究旨在为揭示膜结合型pMMO的催化机制提供新视点。

这一成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上，文章通讯作者为厦门大学化学化工学院王斌举教授，第一作者为厦门大学19级博士彭炜，目前已毕业，现就职于中国科学院地球环境研究所。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Unraveling the Valence State and Reactivity of Copper Centers in Membrane-Bound Particulate Methane Monooxygenase

Wei Peng, Zikuan Wang, Qiaoyu Zhang, Shengheng Yan, and Binju Wang*

J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.3c08834

导师介绍

王斌举

https://www.x-mol.com/university/faculty/243303