当前位置 : X-MOL首页行业资讯 › 多尺度模拟揭示膜结合颗粒甲烷单加氧酶中铜中心的价态、配位和催化反应活性

多尺度模拟揭示膜结合颗粒甲烷单加氧酶中铜中心的价态、配位和催化反应活性

含铜颗粒甲烷单加氧酶(Particulate Methane Monooxygenase, pMMO)在催化甲烷转化为甲醇方面发挥着关键作用,该酶参与甲烷氧化细菌内C1代谢途径的第一步反应,且pMMO在所有甲烷氧化细菌中均广泛表达,使甲烷氧化细菌每年消耗数千万公吨大气甲烷,可有效调控了日趋严峻的温室效应。迄今为止,人们对pMMO结构和催化机理的理解仍非常有限。结构方面,PmoC上存在单铜结合位点(指定为CuC),其配体包括Asp129、His133和His146(图1)。CuC位点具有高度保守性,位于PmoC亚基的无序区域,是纯化pMMO的催化活性中心。而近年来,研究人员将仿生脂质纳米盘与pMMO组装,成功获得了完整的膜内pMMO结构(Science2022375, 1287-1291;Nature Catalysis2023.)在完整的酶结构中,揭示了结合于脂质纳米盘的pMMO内部存在第四个铜位点(指定为CuD,图1),位于PmoC亚基中的保守性残基Asn227、His231和His245负责CuD的结合,而它们在纯化的pMMO中完全缺失。

图1. 膜结合pMMO的甲烷氧化中心为CuD位点,而非CuC位点。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


虽然近年来对pMMO进行了大量的实验和理论计算探索,但是,膜结合型pMMO的保守CuCCuD位点的价态和催化功能仍然尚未获得清晰诠释。重要的是,铜的价态将直接影响配位结构,进而对氧活化机制和整个pMMO的催化循环产生非常深远的影响。事实上,纯化pMMO中CuC(II)的配位构型具有扭曲(或扁平)四面体的几何形状特征。2021年,王斌举教授课题组曾报道了纯化蛋白中CuC(II)介导的氧气活化机制,该过程涉及到了酚类还原剂(如DQH2)的参与,而H2O2是激活O-O键的必要中间体,从而生成对甲烷氧化至关重要的Cu(II)-O•–活性物种(Nature Catalysis20214, 266-273)。然而,脂质纳米盘的重建直接影响了pMMO铜中心的配位和/或价态,这一点通过冷冻电镜结果得以支持。冷冻电镜数据表明单个铜离子可以独占CuCCuD位点,然而,目前尚未检测到铜离子同时占据这两个位点的现象。在活性方面,CuD位点的铜耗尽后,随后进行的铜离子的重新占据可恢复50%的甲烷氧化活性,这无疑就强调了与CuD位点相关的潜在催化活性。


为了从微观尺度阐明膜内天然pMMO的催化反应中心的价态特征和反应活性,厦门大学王斌举教授(点击查看介绍)团队采用了经典的MD、QM/MM MD、QM/MM以及QM计算方法,深入研究了膜结合pMMO所含铜中心,尤其是保守的CuCCuD位点的价态和反应活性。研究表明,CuCCuD位点倾向于Cu(I)的结合,然而,CuCCuD位点不太可能同时被Cu(I)占据。活性方面,在H2O2和Cu(II)-O•–活性物种生成中,CuD(I)位点比CuC(I)位点更具反应活性,此外,动力学模拟表明天然还原剂泛醇(CoQH2)可有效与CuD(I)位点结合,而在CuC(I)位点上结合效果不佳,这就证实了膜结合pMMO的实际活性位点更有可能是CuD,而不是CuC。本研究旨在为揭示膜结合型pMMO的催化机制提供新视点。


这里,QM/MM MD模拟分别设定CuCCuD位点为II价和I价,模拟所得配位结构表明:CuC(II)和CuD(II)中心配位数为4~5,需H2O配位维持稳定,然而CuC(I)和CuD(I)则无H2O配位,配位数仅为3 (图2和3)。结合实验监测的天然/含膜pMMO的CuCCuD的ENDOR信号与冷冻电镜结构,即CuCCuD中心均无法与水分子配位,合理判断膜结合的CuCCuD倾向于I价,配位原子形成了类似等边三角形的排列,而并非等腰直角三角形。

图2. 基于QM/MM MD模拟推导出C链中CuC(II)和CuC(I)的配位几何形状以及关键的配位距离。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


图3. 基于QM/MM MD模拟推导出C链中CuD(II)和CuD(I)的配位几何形状以及关键的配位距离。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


同时,本研究还探讨了Cu(I)在pMMO中的占据对稳定性的影响,并且模拟了CuCCuD位点同时被Cu(I)占据的可能性。对于CuD位点,铜的结合增强了CuD周围残基的稳定性。然而,对于CuC位点,铜的结合与否对周围氨基酸的稳定性影响非常小。另外,对两个铜中心同时被Cu(I)占据后蛋白的构象变化进行了模拟,出乎意料地揭示了保守的 Glu228 将延伸到CuC位点的配位区域,这是在所有冷冻电镜结果中未能发现的现象。由于Glu228与CuC的配位,导致CuCCuD之间的空腔被显著压缩(图4),产生了较大的空间位阻效应,导致类似于DQH2的还原剂分子无法有效结合于催化反应位点。因此,基于QM/MM MD模拟,我们推测CuC 和CuD位点同时占据Cu(I)的可能性较小。

图4. 通过QM/MM MD合理预测了CuCCuD位点同时被Cu(I)占据后,两个位点之间空间的几何变化趋势。其中在CuC位点为手动添加的铜离子。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


基于上述揭示的膜内pMMO的CuCCuD位点的价态和配位结构特征,作者进一步探究了两个铜中心的反应活性。CuC(I)位点活化氧气后需要通过两步氢转移(HAT)过程生成H2O2,然而,MD模拟说明在第一步HAT反应后,生成的DQH•中间体的结合构象相当稳定,难以自发通过构象翻转实现对CuC(II)−OOH的近端O的靠近,基于QM/MM metadynamics,他们合理预测DQH•构象翻转所需的能垒将高达16.1 kcal/mol(1IC1CuC1TS3CuC),加上第一步HAT反应吸热4.3 kcal/mol,该步反应总能垒为20.4 kcal/mol。然而,对于CuD(I)位点,DQH•中间体在MD过程中表现出自发翻转的倾向,导致OH基团非常容易接近CuD(II)−OOH的近端O(图5,IC2CuD)。随后,从DQH•到近端O的HAT可在开壳层单线态下发生,且仅需经历7.2 kcal/mol 的势垒(1IC2CuD1TS3CuD),进而生成H2O2CuD(I)。基于上述QM/MM计算,并结合pMMO-DQH2/CoQH2复合物的MD模拟,我们得出结论,膜结合pMMO中的CuD位点是甲烷氧化的活性中心。

图5. 以CuD(II)−O2•–和DQH2复合物为起始的两步HAT反应生成CuD(I)--H2O2的相对能量值(kcal/mol)。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


图6. 基于MD 模拟获得的CuC位点和CuD位点结合了CoQH2的代表性构象。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


综上,本研究基于以上多尺度模拟可获得以下重要结论:1) 通过对QM/MM MD模拟的配位结构与冷冻电镜结构之间的详细比较,阐明了在CuCCuD位点倾向于Cu(I)的结合,然而,CuCCuD位点不太可能同时被Cu(I)占据,因为这会引起保守的Glu228与CuC位点的协同配位,进而减少CuCCuD之间的空间,使其无法容纳还原剂分子(如DQH2)。2) QM/MM计算表明,在H2O2和Cu(II)-O•–活性物种生成中,CuD(I)位点比CuC(I)位点具有更高反应活性。3) 对天然还原剂泛醇(CoQH2)的对接和MD模拟表明,CoQH2可有效与CuD(I)位点结合,而在CuC(I)位点上结合效果不佳,这就证实了膜结合pMMO的实际活性位点更有可能是CuD,而不是CuC。本研究旨在为揭示膜结合型pMMO的催化机制提供新视点。


这一成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上,文章通讯作者为厦门大学化学化工学院王斌举教授,第一作者为厦门大学19级博士彭炜,目前已毕业,现就职于中国科学院地球环境研究所。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Unraveling the Valence State and Reactivity of Copper Centers in Membrane-Bound Particulate Methane Monooxygenase

Wei Peng, Zikuan Wang, Qiaoyu Zhang, Shengheng Yan, and Binju Wang*

J. Am. Chem. Soc.2023, DOI: 10.1021/jacs.3c08834


导师介绍

王斌举

https://www.x-mol.com/university/faculty/243303 


如果篇首注明了授权来源,任何转载需获得来源方的许可!如果篇首未特别注明出处,本文版权属于 X-MOLx-mol.com ), 未经许可,谢绝转载!

有奖问卷征集新
年货节
材料学领域约200份+SCI期刊
定位全球科研英才
讲述科研故事助力科学传播
中国图象图形学学会合作刊
东北石油大学合作期刊
动物源性食品遗传学与育种
上海交通大学合作刊
第五届中国新发展奖获奖名单
naturemental health
naturecities
特刊大模型安全与隐私
病理、诊断、疫苗、治疗
牛津大学出版社
期刊编辑亲授的在线课程
关注应用数学最新研究
专业英语编辑服务
聚焦高分子材料3D打印技术
关注能源系统及应用
JOURNALS诚邀投稿,欢迎成为我们的作者!
组织工程与器官再造
关注医疗与健康教育
naturecomputationalscience
2022年度论文正式公布
立足当下探索未来科研
关注GIS,GPS 及遥感技术
生物领域230+SCI期刊
屿渡论文,编辑服务
香港理工
中科大
北大
福大
南科大
东华师范
上海交大
多次-上海有机所左智伟
郑大
北大
隐藏1h前已浏览文章
课题组网站
新版X-MOL期刊搜索和高级搜索功能介绍
ACS材料视界
x-mol收录
试剂库存
down
wechat
bug