浙工大葛璟燕课题组JACS：IGF2融合溶酶体靶向嵌合体iLYTAC

近期，浙江工业大学生物工程学院葛璟燕课题组、新加坡国立大学Yao Shao Q.教授、大连理工大学都书博教授联合开发了基于IGF2融合蛋白的溶酶体靶向蛋白降解新技术iLYTAC。相关成果发表于权威期刊Journal of the American Chemical Society。

靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）技术是目前药物研究领域中备受瞩目的新兴技术之一。它突破了传统小分子需强结合位点的需求，可有效靶向降解一些传统抑制剂“不可成药”的靶点。诺贝尔奖得主Bertozzi课题组在2020年首次提出多糖构建的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC），为40%的胞外蛋白的降解开辟了道路。随后，许多研究团队相继开发了一系列基于细胞内吞-溶酶体机制的膜蛋白降解策略，在靶向各种“不可成药”蛋白上展现出巨大的潜力，然而，内吞受体的配体多是外源物，糖类合成、抗体工程复杂，稳定性也有待提高。

LYTAC的溶酶体靶向受体（LTR）是CI-M6PR，也被称为胰岛素样生长因子-2受体（IGF2R），不仅可识别甘露糖-6-磷酸（M6P），也可以与胰岛素样生长因子2（IGF2），并以高亲和力结合，进入溶酶体，从而维持IGF2的水平。本文基于此现象，课题组利用IGF2作为LTR(IGF2R)的配体，构建了两类IGF2融合的重组蛋白iLYTACs，且成功展示其降解细胞外和细胞膜上蛋白的能力，包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR）、程序性死亡配体1（PD-L1）、α-突触核蛋白（α-Syn）和B淋巴细胞抗原CD20（图1）。

图1. iLYTAC技术用于膜蛋白靶向降解示意图

本文共设计并表达了四种I型iLYTAC（IGF2-Af_EGFR、IGF2-Af_Syn、IGF2-Nb_GFP及IGF2-Nb_PDL1）和II型iLYTAC（IGF2-Z）。其中，亲和体、纳米体具有尺寸小、稳定性和溶解度好、易生产、特异性高和免疫原性低等特性，是抗体的优秀替代品。所有蛋白均在大肠杆菌表达体系表达，且通过SDS-PAGE和质谱确定了蛋白纯度和大小。随后，利用荧光标记融合蛋白，通过细胞成像和流式细胞术验证iLYTAC能够被细胞摄取，且与溶酶体共定位。也通过生物膜干涉技术及细胞摄取实验研究了IGF2及iLYTAC的结合活性，结果也表明亲和体及纳米抗体的融合、不同的GGGGS的链长并没有对结合力产生很大影响。

图2. iLYTAC的制备及表征

接下来，作者探索了I型iLYTACs对细胞膜上（EGFR\PD-L1）和细胞膜外(GFP\α-Syn)的降解效率。如，IGF2-Af_EGFR处理后，EGFR在细胞膜上的EGFR转移到了细胞内，且WB结果显示，细胞中EGFR水平的降低呈现时间、浓度依赖（图3）。IGF2- f_α-Syn对神经退行性疾病相关蛋白α-Syn也降解比较明显。

图3. I型iLYTAC的应用

而II型iLYTACs则是由IGF2与抗体恒定区Fc的结合的Z domain融合表达，可用于结合靶蛋白的IgG抗体（如已有的商业化抗体），具有普适性、可高通量筛选抗体药物等特性。同样以EGFR的单抗药物西妥昔单抗（Cet）为例，IGF2-Z能够将抗体带入到细胞中并定位溶酶体。WB结果也说明，Cet在与IGF2-Z联合给药时，能够降低细胞中EGFR的表达水平。

图4. II型iLYTAC的应用

最后，通过使用HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤模型，评估了(IGF2-Z + Cet)和 IGF2-Af_EGFR对治疗小鼠的抗肿瘤作用。以Cet、Af_EGFR或IGF2-Z处理作为对照。IGF2-Z + Cet处理的小鼠肿瘤重量下降了近50%，而IGF2-Af_EGFR处理的小鼠肿瘤重量变化较小。进一步WB分析肿瘤中EGFR表达水平，结果显示，肿瘤两类iLYTACs的处理能显著降低肿瘤中EGFR的水平。该研究结果也表明iLYTACs能够提升EGFR靶向耐药型肿瘤的治疗效果。

图5. 两类iLYTACs在肿瘤模型上的应用

总之，本文成功报道了重组嵌合IGF2融合蛋白，用于降解细胞外蛋白和膜蛋白。该策略便捷、有效、且可以通用化、模块化，为膜蛋白及膜外蛋白的药物开发、抗体药物的改善、耐药性的降低等等提供了强有力的工具，为重组蛋白类溶酶体靶向蛋白降解平台的设计开辟了新思路。当然，作者也提到一些相关缺点，如体内代谢快、降解周期相对长，仍需在后续工作中深化。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Insulin-like Growth Factor 2 (IGF2)-Fused Lysosomal Targeting Chimeras for Degradation of Extracellular and Membrane Proteins

Bei Zhang, Rajeev Kungur Brahma, Liquan Zhu, Jiayi Feng, Shiqi Hu, Linghui Qian, Shubo Du*, Shao Q. Yao*, and Jingyan Ge*

J. Am. Chem. Soc., 2023, 145, 24272–24283, DOI: 10.1021/jacs.3c08886

研究团队简介

葛璟燕，教授，博士生导师。先后毕业于浙江大学（本科）、新加坡国立大学（博士）。现为浙江工业大学生物工程学院教授。课题组近年来在Acc. Chem. Res.、J. Am. Chem. Soc.、ACS Cent. Sci.、ACS Chem. Biol.等国际知名期刊发表40余篇。入选浙江省“特聘专家”、浙江省中青年学科带头人、浙江省“高校领军人才培养计划”高层次拔尖人才。课题组专注于化学与生命科学的前沿交叉研究，着力构筑适用于“原位”研究蛋白质功能的分子工具，实现在分子层面上对蛋白质（组）的精准探测和调控。欢迎感兴趣的博士后和研究生联系并申请加入。