中科院微生物所尹文兵团队Angew：多硫代二酮哌嗪非典型α, β'-二硫桥的新颖形成机制

2023年3月，中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室尹文兵（点击查看介绍）研究团队通过解析α, β'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，揭示了多硫代二酮哌嗪类化合物（ETP）次级代谢产物隐秘结构多样性的形成机制（Angew. Chem., 2023, 135, e202217212）。该研究团队近日在化学领域权威期刊Angewandte Chemie 再次发表文章，解析了α,β'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，揭示了关键中间体邻亚甲基苯醌（ortho-quinone methide，o-QM）参与非典型α, β'-二硫桥形成的新颖酶催化机制。

多硫代二酮哌嗪类化合物（Epidithiodiketopiperazines，ETPs）是一类具有生物和医学意义的重要环二肽，根据跨环二硫桥在二酮哌嗪母核（DKP）的连接位置，ETPs分为两类，分别具有α, α'-和α, β'-二硫桥，该结构单元与ETPs生物活性密切相关。以烟曲霉GliT为例，已有研究证实具有CXXC motif的黄素依赖型氧化酶催化α, α'-二硫醇的氧化，形成α, α'-二硫桥；2021年，尹文兵研究团队通过体外蛋白应，发现具有CXXC motif的黄素依赖型氧化酶GliT和TdaR也能催化α, β'-二硫醇的氧化，形成α, β'-二硫桥（Chem. Sci., 2021, 12, 4132-4138）（图1）。Hertweck课题组通过解析阿司匹氯（aspirochlorine）的生物合成，揭示了具有CXXH motif的黄素依赖型氧化酶AclR催化α, α'-二硫桥的迁移，形成α, β'-二硫桥，然而，其催化机制未被完全解析。

图1. 前人报道的α, α'-二硫桥（A）和α, β'-二硫桥（B）形成机制

前期研究中，尹文兵研究团队通过解析α, β'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，鉴定了7个关键的Tda修饰酶，发现超过20个隐秘的ETP类化合物，揭示了该类次级代谢产物结构多样性的形成机制，为该类化合物的定向挖掘及多样性创制提供了新思路（Angewandte Chemie, 2023, 135, e202217212）。本项研究旨在解析α, β'-二硫桥形成前的生物合成步骤，阐明pretrichodermamide A中非典型α, β'-二硫桥的形成机制。

作者首先对炭团木霉tda基因簇内的细胞色素氧化酶编码基因tdaQ和tdaI进行双敲除，成功鉴定具有α, β'-二硫桥和呋喃环的生物合成中间体5。通过簇内修饰基因敲除和次级代谢产物分离，共鉴定20个新结构，其中大多数为pretrichodermamide A生物合成中的分支途径产物，体现了非沉默途径中隐秘次级代谢产物结构的多样性。对这些结构进行分析，作者推测了α, β'-二硫桥形成前的pretrichodermamide A生物合成步骤（图2）。非核糖体多肽合成酶TdaA催化形成环苯丙氨酸（cFF，4），经过氧化、谷胱甘肽引入、水解等步骤后，形成具有α, α'-二硫醇和β'-羟基的中间体9；紧接着，具有CXXC motif的黄素依赖型氧化酶TdaR负责氧化α, α'-二硫醇，形成α, α'-二硫桥（10）；乙酰基转移酶TdaF催化β'-羟基的乙酰化，形成11；细胞色素P450氧化酶TdaP催化C5', C6'-羟基化，形成12。以上步骤中形成的α, α'-二硫桥、β'-乙酰基和C5', C6'-羟基，是构建α, β'-二硫桥的先决条件，体外蛋白反应证实具有CXXQ motif的黄素依赖型氧化酶TdaE经由关键中间体o-QM，催化α, α'-二硫桥的迁移，进而形成非典型的α, β'-二硫桥（5）（图3）。

图2. Pretrichodermamide A中α, β'-二硫桥形成前的生物合成步骤和隐秘结构多样性

图3. 黄素依赖性氧化酶催化α, β'-二硫桥的形成。（A）关键中间体o-QM（20）参与TdaE、TdaE_Q140H催化的化合物12的二硫桥转移，形成α, β'-二硫桥（5）；（B）真菌中硫桥形成相关的黄素依赖型氧化酶的进化分析。

通过序列比对和蛋白晶体结构预测，对CXXQ motif中的半胱氨酸残基（C137）和谷氨酰胺残基（Q140）分别进行定点突变，成功构建突变体TdaE_C137A、TdaE_Q140C、TdaE_Q140A和TdaE_Q140H。体外蛋白反应结果表明，只有TdaE_Q140H能催化化合物12的二硫桥迁移，形成具有α, β'-二硫桥的化合物5（图3A和4A）。基于以上结果，作者推测了一个新颖的α, β'-二硫桥酶催化机制，谷氨酰胺残基（Q140）或者组氨酸残基（H140）夺取C5'-羟基氢，使得β'-乙酰基基团离去，形成关键中间体o-QM（20）；紧接着，半胱氨酸残基（C137）进攻α, α'-二硫桥，使其发生迁移，形成α, β'-二硫桥和呋喃环（5）（图4B）。

系统进化分析结果发现，真菌硫桥形成相关的黄素依赖型氧化酶分为四类：第一类，以GliT、TdaR、AclD、AtaT为代表，具有高度保守的CXXC motif；第二类，以TdaE为代表，具有CXXQ motif，参与pretrichodermamides的生物合成；第三类，以AclR为代表，具有CXXH motif，参与阿司匹氯（aspirochlorine）的生物合成；第四类，以AclT为代表，具有IXXH motif（图3B）。结合体外蛋白反应，作者得出结论，具有高度保守CXXC motif的黄素依赖型氧化酶负责催化硫醇氧化，形成二硫桥结构；具有CXXQ和CXXH motif的氧化酶经由关键中间体o-QM，催化α, α'-二硫桥的迁移，形成非典型的α, β'-二硫桥。

图4. ETP中非典型α, β'-二硫桥的形成机制。（A）TdaE和突变体TdaE_Q140H的晶体结构预测分析；（B）黄素依赖型氧化酶催化α, β'-二硫桥形成的机制；（C）ETP类次级代谢产物非典型α, β'-二硫桥的生物合成步骤。

综上所述，本项研究通过解析α, β'-二硫桥形成前的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，证实了关键中间体o-QM参与ETP中二硫桥的迁移，形成非典型α, β'-二硫桥，揭示了二酮哌嗪骨架α, β'-二硫桥的普适性形成机制（图4C），为ETP活性分子的酶法创制提供了理论基础。

相关工作发表在Angewandte Chemie International Edition 上。中科院微生物所尹文兵研究员为本文通讯作者，特别研究助理范洁博士和冉火苗博士为共同第一作者，博士研究生魏鹏霖、硕士研究生李媛媛和已毕业学生刘欢博士做出了重要贡献，德国马尔堡大学李书明教授给予了大力支持。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院从0到1原始创新项目、中国科学院战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库项目和博士后科学基金的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

An ortho-Quinone Methide Mediates Disulfide Migration in the Biosynthesis of Epidithiodiketopiperazines

Jie Fan, Huomiao Ran, Peng-Lin Wei, Yuanyuan Li, Huan Liu, Shu-Ming Li, Wen-Bing Yin

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202304252

导师介绍

尹文兵

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