转氨酶催化性能预测模型及应用

手性胺类化合物是重要的有机合成中间体，也是众多生物活性化合物的重要组成基元。作为合成手性伯胺的优选生物催化剂，转氨酶可以催化氨基在供体和受体之间的可逆转移反应，此反应不需要额外的辅因子再生系统，且往往具有优异的立体选择性，因此得到学术界和工业界的广泛关注，并被成功应用于西格列汀等药物的生产中。针对野生型转氨酶催化性能不高的问题，人们发展了多种理性设计和筛选方法进行蛋白质工程，以获得更高的活性、更广泛的底物范围和对特定底物更好的立体选择能力。

随着人工智能革命影响到人类生产和生活的各个方面，传统的研究模式也在发生着根本性的变化。具体到生物催化领域，机器学习已被用于蛋白质的理性改造，从而调节诸如环氧化物水解酶、还原胺化酶等生物催化剂的催化活性或立体选择性。这种数据驱动的策略可以通过从收集的数据中识别催化模式，来设计新的突变组合，因此该策略有望大大减少传统策略所需的计算和实验工作。机器学习的成功与否，其关键在于训练数据的质和量。然而，现有的生物催化相关数据库往往缺乏足够数量的、多样性高的催化性能数据，这些数据也很难表示成计算机可读的输入特征（即描述符）。因此，如何有效地获取高质量的数据并从中提炼出适用的描述符，已成为这一领域的主要挑战。正是由于上述困难，迄今尚无转氨酶催化性能预测模型被报道。

中国科学院化学研究所敖宇飞副研究员在德国Greifswald大学U. T. Bornscheuer课题组访学期间（2021.3-2023.3），与北京师范大学理论及计算光化学教育部重点实验室申林教授展开合作，利用基于结构的理性改造策略快速获得多样性高的催化性能数据，并设计出一套改进型独热（one-hot）描述符，用以描述底物和氨基酸的电子效应和位阻效应；在此基础上建立梯度提升回归树（GBRT）模型，成功地预测了转氨酶3FCR催化不同底物反应的活性和立体选择性，进而不断加入新的数据，提升机器学习模型性能；此外还将其应用于设计具有更高催化性能的突变体，展示了数据驱动的蛋白质工程的应用潜力。

作者首先在Bornscheuer课题组所报道的转氨酶3FCR的结构和催化机制基础上，找到了可能影响其催化活性和选择性的七个关键氨基酸，并利用基于结构和机理的理性设计实现其针对苯乙胺类底物的催化活性调控和催化对映选择性的反转，在此过程中收集到高多样性的催化性能数据（图1）；随后考察了这些突变体催化其它13种含有不同取代基的底物的反应活性和立体选择性，收集到针对不同底物的催化性能数据（图2），值得一提的是，反应活性的测量利用了实验室之前建立的高通量活性测量方法（测量图1所示反应体系在245 nm的紫外吸收强度变化从而计算苯乙酮产物生成速率），并通过比较R构型底物和S构型底物的反应活性来推测这类反应的立体选择性。

图1. 3FCR突变体催化模型底物（R或S-苯乙胺）反应的比活性

图2. 不同3FCR突变体催化不同底物反应的比活性

在获得上述催化性能数据后，作者设计了一套改进的独热编码描述符，将酶关键氨基酸和底物的结构信息作为输入特征，以催化活性为标签，建立了梯度提升回归树模型，其预测精度初步满足理论设计的要求（图3A）；随后将此模型用于底物或突变体的虚拟筛选，找到了一系列针对不同的底物具有更高催化活性或立体选择性的突变体。与已有的突变体相比，这些利用数据驱动策略设计的突变体活性提高可达3倍（图3B）。作者进一步将这些新样本加入数据集，对机器学习模型开展迭代优化，不断提升其预测能力（图3C）。通过分析特征重要性（图3D），作者发现转氨酶3FCR的87位、19位和231位氨基酸侧链的立体效应对酶催化活性的影响更为显著，展示了一种酶催化机理研究的新模式。

图3. 不同突变体催化不同底物反应的比活性

这一成果近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，中科院化学所敖宇飞为论文第一作者和共同通讯作者，北京师范大学申林和德国Greifswald大学U. T. Bornscheuer为论文共同通讯作者，在研究工作中做出重要贡献的还有：北京师范大学的裴书鑫、Greifswald大学的相超、M. J. Menke、孙成海和M. Dörr，以及柏林工业大学的S. Born和M. Höhne。本工作得到了科技部重点研发计划（2019YFA0709400）、国家自然科学基金（21977098, 22193041）以及中国科学院访学基金的支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Structure- and data-driven protein engineering of transaminases for improving activity and stereoselectivity

Yu-Fei Ao, Shuxin Pei, Chao Xiang, Marian J. Menke, Lin Shen, Chenghai Sun, Mark Dörr, Stefan Born, Matthias Höhne, Uwe Bornscheuer

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, 62, e202301660. DOI: 10.1002/anie.202301660