P450酶环境对分子内选择性C-N成键的调控机制

P450酶能够催化多种反应并在许多生物过程中起重要作用。在P450催化的众多反应中，C-N选择性成键反应备受瞩目，这是因为含氮杂环是药物中最常见的官能团之一。2019年，日本Abe教授课题组解析得到了第一个催化分子内C-N成键的P450酶 (P450 TleB) 与底物的复合体结构。^[1] 而在此之前，对P450酶催化的C-N成键已有多种推测机理，包括环氧化路径、自由基进攻路径以及双自由基耦合路径等。^[2] 基于复合体晶体结构，Abe教授等人推测反应第一步可能是活性物种Cpd I 介导的氢原子转移反应，接下来底物自由基可能发生构象转化，第二个氢转移生成底物双自由基，双自由基耦合生成目标C-N成键。但是，P450 TleB如何精准调控底物的构象转化以及选择性C4-N13成键仍不清楚。

图1. 本研究揭示的P450 TleB催化分子内C-N成键的机理

通过分子动力学、量化计算、经典/量子混合计算等，作者验证了Abe教授等人提出的P450 TleB选择性催化C-N成键的双自由基耦合机理（图1）。有意思的是，自旋布居分析表明吲哚自由基中C3（-0.6）位的自旋密度远大于C4位（-0.2），这说明C3位的反应活性高于C4位。事实上，QM/MM计算结果表明，在不考虑底物构象翻转时，C3-N13之间的耦合反应是比C4-N13更有利的。而这与实验结果明显不符。

图2. 底物双自由基物种的自旋布居。

通过LiGaMD增强采样方法，作者得到了底物构象转变过程的原子层次的图像：第一步是吲哚环的翻转；第二步是N13-H基团向Cpd II活性中心的靠近。其中，吲哚环的翻转是底物构象转变的限速步，需要跨越大约10 kcal/mol的能垒。值得注意的是，在新构象（Conf. 2）中，N13-H基团不仅靠近了活性中心Cpd II，也和C4保持理想的成键距离。从该构象出发，不仅第二个氢转移的能垒得到了显著的降低，双自由基耦合过程中N13也选择性地与C4发生反应，从而得到了和实验一致的选择性。

图3. (A) 底物自由基构象转变的2维势能面；（B）构象转变前后对比。

进一步的研究分析表明，吲哚环的翻转是由其偶极矩的变化引起的。在第一个氢原子转移之前，吲哚环处的蛋白内电场与其偶极矩方向相同，起到了稳定作用（RC）；而当N1-H的氢原子转移之后，吲哚环的偶极矩方向发生了反转，此时蛋白内电场与偶极矩的方向相反，增加了底物的机动性（IC1），促使了底物构象转变的发生。另外，吲哚环翻转之后，其偶极矩再一次与内电场方向同向，从而稳定了翻转之后的构象（IC1c）。理论研究明晰了蛋白环境如何精准调控C-N偶联反应的选择性，为其它更多P450催化的C-N/C-S偶联反应提供了借鉴。

图4. 不同物种中吲哚环偶极矩（蓝色箭头，单位：德拜）与蛋白内电场（红色剪头，单位：MV/cm）的相互作用。注意，蛋白内电场显示的是沿偶极矩方向的投影。

相关成果发表在J. Am. Chem. Soc.上。文章的第一作者为北京师范大学先进材料研究中心王展峰特聘副研究员，文章的通讯作者为王展峰特聘副研究员和厦门大学王斌举教授。该研究工作得到了国家重点研发计划“合成生物学”重点专项基金 (2019YFA0906400)、国家自然科学基金（22203007, 22073077和22122305）以及北京师范大学科研启动基金 (310432104)的支持。

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How the Conformational Movement of the Substrate Drives the Regioselective C−N Bond Formation in P450 TleB: Insights from Molecular Dynamics Simulations and Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Calculations

Zhanfeng Wang*, Wenwen Diao, Peng Wu, Junfeng Li, Yuzhuang Fu, Zhiyong Guo, Zexing Cao, Sason Shaik, and Binju Wang* 

J. Am. Chem. Soc., 2023, 145, 7252–7267, DOI: 10.1021/jacs.2c12962

参考文献：

[1]: He, F.; Mori, T.; Morita, I.; Nakamura, H.; Alblova, M.; Hoshino, S.; Awakawa, T.; Abe, I. Molecular basis for the P450-catalyzed C-N bond formation in indolactam biosynthesis. Nat. Chem. Biol. 2019, 15, 1206−1213.

[2]: Tang, M. C.; Zou, Y.; Watanabe, K.; Walsh, C. T.; Tang, Y. Oxidative Cyclization in Natural Product Biosynthesis. Chem. Rev. 2017, 117, 5226−5333.

王展峰博士简介

王展峰，北京师范大学珠海校区先进材料研究中心特聘副研究员。2017年于中国科学院物理研究所取得博士学位，2017.7-2019.4在以色列希伯来大学Sason Shaik教授课题组从事博士后研究，2019.7-2022.3在厦门大学王斌举教授课题组继续博士后研究，2022年3月加入北京师范大学珠海校区。

王展峰博士主要应用分子动力学（MD）模拟、量化（QM）计算、QM/MM以及QM/MM MD等计算手段研究酶的催化机理。目前已在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Catal.等期刊发表论文十多篇。欢迎感兴趣的同学联系（zfwang@bnu.edu.cn）并加入本课题组。

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