近红外探针用于Aβ蛋白聚集体的特异性成像和光氧化调控

阿尔兹海默病（AD）是最主要的神经退行性疾病之一，发病的过程伴随着记忆力衰退、认知功能障碍和身体机能恶化等。据世界卫生组织最新数据显示，2019年患痴呆的人数估计为5500万人，预计2050年将增至1.39亿。令人遗憾的是，目前没有可以有效治疗或预防AD的药物。

蛋白质的异常折叠与很多疾病相关，比如多种神经退行性疾病。β淀粉样蛋白（Aβ）是AD的主要病理标志物之一，这是由Aβ单体不正确聚集诱导形成的具有神经毒性的聚集体。目前，基于Aβ蛋白为靶点的治疗AD的策略主要集中在干扰Aβ的异常组装形成聚集体或者是分解已形成的原纤维。通过开发具有特异性的光氧化分子，产生单线态氧来光氧化Aβ，降低Aβ带来的神经毒性，是一种新兴的AD治疗策略。目前文献研究报道的光敏剂大多由于激发光源过短，难以穿透深层组织，或存在脱靶行为，使正常组织或细胞出现脱靶性损伤。近日，华南理工大学张雷、颜金武团队和南开大学肖乐辉团队，开发了一系列可用于特异性成像以及光氧化调控Aβ聚集的近红外光敏剂。

该团队设计了一系列D-π-A光敏剂（QM20-QM22），以喹啉鎓骨架为电子受体，并采用靶向传感催化剂活化（TaSCAc）的策略，引入具有Aβ聚集靶向性的二甲基苯胺基团作为电子供体，以减少光敏剂的脱靶行为。当光敏剂分子结合靶标之前，扭曲分子内电荷转移（TICT）过程的快速非辐射衰变为主要能量耗散过程，光敏剂产生弱发射和低的单线态氧（¹O₂）。当光敏剂与Aβ聚集体的特异性结合之后，TICT过程导致的非辐射跃迁减弱，使得荧光发射以及单线态氧的产生增加，从而实现对Aβ聚集体的特异性成像与光氧化。

图1. (a) 光敏剂QM20-QM22的化学结构。(b) 获得的 QM20-QM22 的紫外-可见吸收光谱。(c) 获得的QM20-QM22荧光光谱。(d) 光敏剂与Aβ结合的荧光增强比。(e-g) 仅针对 QM20-QM22 以及与 Aβ 聚集体、低聚物、单体、BSA 和 HSA 结合时获得的荧光发射光谱。图片来源：Anal. Chem.

图2. (a) 在皮层区域的APP/PSI小鼠脑切片用Th-S（2 μM）和QM20-QM22 (2 μM）共标记的Aβ原纤维的共聚焦光学显微镜图像。比例尺：250 μm。(b) 与ThT和光敏剂QM20-QM22共标记的Aβ原纤维的荧光图像。比例尺：5 μm。图片来源：Anal. Chem.

实验结果表明，QM20-QM22对Aβ聚集体均有特异性的荧光开启响应，其中QM21尤为突出。另外，在体外的APP/PS1小鼠脑皮质切片和溶液状态的Aβ成像中都可以和商业染料Thio-S或ThT很好的共定位效果。这些实验表明QM20-QM22具有较高的选择性，在Aβ聚集体成像中具有一定的应用前景。

图3. QM20-QM22的生成¹O₂的能力评价。(a-d) 计算的能量差 (ΔE_st) 和ωB97X-D/Def2svp理论水平上单重态和三重态之间的自旋-轨道耦合 (SOC) 值，以及S1和T2主跃迁轨道的分布。(e-g) 在不同条件下(QM + Aβ + Laser, QM + Aβ + Dark, QM + Laser, QM + Dark, laser = 532 nm) 下观测到的 QM20-QM22 下 SOSG 的荧光强度。(h) 在 QM20-QM22 中观察到的有/没有 Aβ 的 SOSG 的荧光强度。(i-k) 使用MTT测定SH-SY5Y细胞的细胞活力测定。图片来源：Anal. Chem.

单线态氧是光氧化Aβ的重要分子。该文章通过理论计算和实验的方法来阐明和验证QM20-QM22的单线态氧的生成。低的单重态-三重态能隙（ΔE_st）和大的自旋-轨道耦合（SOC）有利于单线态氧的产率。在QM20-QM22这三个光敏剂的ΔE_st分别低至0.1879 eV、0.1586 eV 和 0.1604 eV，SOC分别是0.2074 cm^–1、0.1640 cm^–1和0.1237 cm^–1. 实验数据也支持理论计算结果，QM20-QM22都有较好产生单线态氧的能力。此外，在神经细胞活力测试也表现出了低毒性。

图4. 通过QM21的光氧合抑制Aβ聚集。（a-b）使用荧光共聚焦显微镜监测加入QM21后在0-24小时之间在有/没有激光照射（532nm）的特定时间点的Aβ的状态。（c）在黑暗条件下用QM21染色0-24小时的Aβ蛋白的相应长度。（d）加入QM21后用激光照射（523nm）从0-24小时的 Aβ蛋白的相应长度。（e）加入QM21激光照射后用MALDI-TOF-MS分析Aβ蛋白的分子质量变化。图片来源：Anal. Chem.

图5. 通过QM21的光氧合降解Aβ聚集体。（a-b）加入QM21使用共聚焦显微镜监测在有/没有激光照射 （532 nm）的情况下，0 -3/20 小时之间的特定时间点的 Aβ 聚集体的状态。（c）加入QM21在0至24小时的黑暗条件下，Aβ聚集体的相应长度。（d）加入QM21和激光照射（523nm）的Aβ聚集体0-3小时的相应长度。图片来源：Anal. Chem.

考虑到QM21的近红外的发射波长以及高的单线态氧的产生能力，作者进行了QM21光氧化Aβ蛋白活性的评价。将Aβ单体与QM21孵育后，发现在黑暗情况下，Aβ单体会进一步聚集成纤维状，而光照组的单体没有明显的聚集，说明QM21可以光触发抑制Aβ的聚集。另外，在光照条件下，QM21也显示出解聚Aβ聚集体的能力。通过MALDI-TOF-MS分析分子光照组的Aβ蛋白发现，分子质量有规律性增加16、32和48Da，表明是Aβ蛋白中的部分氨基酸残基被光氧化了。综合上述结果，说明QM21在光触发下特异性抑制Aβ聚集和解聚Aβ聚集体。

图6. (a) 在黑暗和明亮照射条件下用QM21处理后细胞对FAM-Aβ的摄取。比例尺：50 μm。(b) (a)中Aβ的相应荧光强度。图片来源：Anal. Chem.

Aβ的清除取决于各种免疫机制和肽酶的降解。文章进一步研究了被光氧化的Aβ是否可以促进BV2细胞的摄取与消化。图6显示，在只有当加入QM21和光照时，细胞内才出现比较明显的绿色的Aβ的荧光，表明，被QM21光氧化的Aβ更容易被BV2细胞进行摄取，进而增加Aβ的清除。

图7. QM21诱导的Aβ聚集体光氧合对PC12细胞活力的影响（QM21，5 μM，Aβ，20 μM，光照时间为1小时，孵育24小时，n = 6，平均±标准偏差，*p<0.1，**p<0.01，***p<0.001通过t-test）。图片来源：Anal. Chem.

基于以上研究结果，作者进一步研究了QM21光氧化对PC12细胞活力的影响。图7显示了Aβ聚集体对PC12细胞（E组和F组）具有较大的细胞毒性。与E组相比，添加QM21且未进行光照射的G组表现出可忽略的干扰。值得注意的是，光照下的H组的PC12细胞的活力远高于E组和F组，表明QM21对Aβ聚集体的光氧化可以降低其神经毒性。

在QM20-QM22三个光敏剂在激光光照下产生单线态氧，表现出优异的定位、降解Aβ聚集体和抑制Aβ聚集的能力。其中，光敏剂QM21是表现出了最优异的成像和调控Aβ聚集过程的能力，它在结合蛋白后荧光量子产率增加了95倍，并且伴随着单线态氧生成的增强。另外，这一系列光敏剂可以通过光氧化Aβ蛋白来促进小胶质细胞对Aβ的吞噬功能，减弱Aβ引起的神经细胞毒性。光敏剂QM21的优异性能使在AD的诊疗基础研究领域具有较好的应用前景。

这一成果最近发表在Analytical Chemistry 上，文章的通讯作者为华南理工大学颜金武副教授和南开大学肖乐辉教授，文章的第一作者为华南理工大学硕士研究生杨金荣和南开大学博士研究生王鑫。

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Near-Infrared Photooxygenation Theranostics Used for the Specific Mapping and Modulating of Amyloid-β Aggregation

Jinrong Yang, Xin Wang, Jinsheng Liu, Weijie Chi, Lei Zhang, Lehui Xiao*, and Jin-wu Yan*

Anal. Chem., 2022, 94, 15902–15907, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04042