Chem：共价蛋白药物，高效中和新冠病毒

新冠（COVID-19）疫情爆发后，我们急需针对新冠病毒（SARS-CoV-2）的药物用来预防和治疗新冠。传统的蛋白药物（抗体和纳米抗体等）与SARS-CoV-2的结合是非共价且可逆的，所以当它们与SARS-CoV-2解离时，SARS-CoV-2可以与血管紧张素转化酶2（ACE2）受体结合，完成细胞的感染。因此，传统的蛋白药物无法对病毒进行完全抑制。相比于非共价药物，共价药物可以增强活性和延长药效，并且可以减弱抗药性的产生。尽管已经有许多共价小分子药物上市，但共价蛋白药物的设计开发却更有挑战性，因为天然的蛋白缺乏能够与靶点高效形成共价键的官能团。

最近，加州大学旧金山分校的Lei Wang课题组发展了一种针对新冠病毒的共价蛋白药物（图1）。该课题组合成了一个新的非天然氨基酸fluorine-substituted fluorosulfate-L-tyrosine（FFY），并通过扩展密码子技术（Genetic code expansion）将其插入蛋白中。FFY插入的蛋白能与新冠病毒的刺突蛋白RBD（spike protein RBD）共价连接，从而阻断刺突蛋白与ACE2受体的结合，进而中和病毒。与非共价蛋白相比，FFY共价蛋白的中和活性提高了41倍。这一策略在包括Alpha、Delta、Epsilon、Lambda和Omicron在内的多种新冠病毒变体中有效。这一成果发表在Chem上，第一作者为博士后于炳辰和博士后李珊珊。

图1. 针对新冠病毒的共价蛋白药物和新的非天然氨基酸FFY。图片来源：Chem

该课题组通过“临近触发反应”（Proximity-enabled reactivity）的机理来实现了共价蛋白药物设计（图2）。通过扩展密码子技术，将一个携带fluorosulfate官能团的非天然氨基酸FSY插入到了纳米抗体（nanobody）中（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 4995-4999）。Fluorosulfate有生物反应活性，但反应性很弱，所以在生物体系中比较稳定。当携带fluorosulfate的纳米抗体与刺突蛋白结合时，将fluorosulfate与刺突蛋白RBD上的氨基或羟基置于非常靠近的位置，促进了硫氟交换（sulfur fluoride exchange, SuFEx）反应，形成共价键。该课题组曾将这种策略应用于PD-1/PD-L1中，设计了针对PD-L1的共价蛋白药物（Cell, 2020, 182, 85-97.e16）。在这篇文章中，该课题组将其应用于针对新冠病毒的共价蛋白药物的开发。

图2. “临近触发反应”机理实现共价蛋白药物设计。图片来源：Chem

作者首先将FSY插入到纳米抗体H11-D4、R17-K99Y、SR4和mNb6，在做了与刺突蛋白RBD的共价连接测试之后，选定了纳米抗体mNb6进行了进一步的研究（图3）。作者将FSY插入到mNb6的3个可变区（CDR1到CDR3）的30个位点，并且找到了9个位点可与刺突蛋白RBD形成共价连接。在进一步比较了这9个位点的形成共价键速率后，作者最终选定了108为作为FSY的插入位点。尽管有mNb6与刺突蛋白RBD晶体结构，作者依旧尝试了在可变区的全部30个位点插入FSY并测定了每个位点与刺突蛋白RBD的共价连接效率。这些全部的突变以及共价连接测试工作，仅需2到3周，作者以此来强调该策略的高效性。

图3. 在纳米抗体mNb6插入FSY后可以使其与刺突蛋白RBD实现共价连接。图片来源：Chem

共价蛋白药物的活性与它能够跟靶点形成共价键的速率直接相关。为了提高共价键形成的速率，作者设计合成了一个新的非天然氨基酸FFY。在FSY的基础上，FFY在苯环上引入了一个氟原子，以此提高硫氟交换反应速率，进而加快共价蛋白药物与其靶点形成共价键的速率，提高共价蛋白药物的活性（图4）。FFY合成方法简单，仅需两步即可合成。作者进而验证了FFY可以被高效准确的插入到蛋白中。在将其插入mNb6的108位点后，与之前的FSY相比，FFY使mNb6与刺突蛋白RBD的共价连接速率快了2.4倍。更可喜的，FFY在插入蛋白后很稳定，FFY插入的蛋白在冻干后可在4 ℃长期保存而不影响活性。

图4. 新的非天然氨基酸FFY提高了反应速率。图片来源：Chem

接下来，作者测试了共价纳米抗体的活性（图5）。FFY插入到mNb6的108位点的共价纳米抗体被命名为mNb6(108FFY)，与非共价的mNb6相比，mNb6(108FFY)中和SARS-CoV-2的活性提高了41倍。共价纳米抗体mNb6(108FFY)的IC₅₀为1.7 nM，而非共价的为69.9 nM。mNb6(108FFY)还可以有效中和SARS-CoV-2的多个变体，比如Alpha、Delta、Epsilon和Lambda，并且活性比非共价的mNb6有着23-39倍的提高。

图5. 共价纳米抗体mNb6(108FFY)与非共价纳米抗体相比，极大提高了活性。图片来源：Chem

最后，作者应用这一策略，将ACE2受体改造成了共价蛋白药物，以此验证该策略的广泛适用性（图6）。基于ACE2受体和刺突蛋白RBD的结晶结构，作者将FSY插入到了ACE2受体的30、34和37等6个位点。经过体外与刺突蛋白RBD的共价连接测试，作者发现在ACE2受体的34位点插入FSY（ACE2(34FSY)）能与刺突蛋白RBD形成高效连接。经过质谱分析，作者进一步验证了位于ACE2受体的34的FSY位点是与刺突蛋白RBD的417位的赖氨酸（K417）发生了反应。许多新冠病毒的变体，比如Beta和Omicron，417位的赖氨酸突变为了天冬酰胺（K417N）。作者发现，ACE2(34FSY)无法与携带K417N的变体比如Beta和Omicron形成共价连接，但可与K417位无突变的变体比如Alpha和Delta形成高效共价连接（图6D）。这证明了ACE2(34FSY)和这种共价药物策略的高度特异性。作者还表示，尽管ACE2(34FSY)无法与携带K417N的变体形成共价连接，但这个潜在的劣势是可以克服的，因为可以在ACE2受体的其它位置插入FSY，来瞄准除K417外的其它带有氨基或者羟基的氨基酸。除此之外，作者还利用另外一个纳米抗体Nb70，验证了在Nb70的56为插入FFY后（Nb70(56FFY)），可与包括Alpha、Beta、Delta、Lambda和Omicron在内的多个变体形成高效的共价连接。其中Beta和Omicron都携带K417N的变异，证明K417N变异是可以被这种共价药物策略所克服的。

图6. ACE2受体改造为共价蛋白药物。图片来源：Chem

小结

Lei Wang课题组通过扩展密码子技术和“临近触发反应”的机理来实现了针对新冠病毒的共价蛋白药物设计。这种策略可用在纳米抗体和多种蛋白上，并且具有高特异性。最重要的是，与非共价的蛋白药物相比，共价蛋白药物在活性上有20 到40倍的提高。该策略还可以推广到其它的感染性疾病。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Accelerating PERx reaction enables covalent nanobodies for potent neutralization of SARS-CoV-2 and variants

Bingchen Yu, Shanshan Li, Takako Tabata, Nanxi Wang, Li Cao, G. Renuka Kumar, Wei Sun, Jun Liu, Melanie Ott, Lei Wang

Chem, 2022, DOI: 10.1016/j.chempr.2022.07.012

导师介绍

王磊，UCSF药物化学系，心血管研究所和综合癌症中心教授。UC Berkeley博士，师从Peter Schultz；博士后师从Roger Tsien。课题组聚焦在活细胞和活体生物中遗传编码非天然氨基酸，用于研究生命过程和创建新的生物医药。课题组现招聘博士后两到三名，具有有机合成，化学生物学，癌症和免疫治疗，RNA生物学，或糖生物学背景者优先考虑。工资起薪$55,632，逐年增加。有意者请参阅课题组网站：https://pharm.ucsf.edu/wang    

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