C-核苷天然产物恶嗪霉素的生物合成

C-核苷是呋喃糖与碱基以碳碳键相连的一类化合物，相比于常见的N-核苷，C-核苷具有更高的抗降解代谢的稳定性。因其与N-核苷的结构类似，许多天然以及合成的C-核苷可以代替并参与到核糖核酸的合成，或影响N-核苷的合成代谢，因而具有抗菌，抗肿瘤，抗病毒等生物活性。其中广为人知的新例是2020年通过美国药监局审批的抗新冠药物瑞德西韦（Remdesivir）（图1）。天然C-核苷自发现以来，其生物合成的途径就成为生物化学界研究的热门课题，尤其是其碳碳核苷键的形成以及其独特于N-核苷的复杂碱基杂环的建构，迄今仍未能完全了解，其中可能包含了丰富而未知的酶催化反应过程。

图1. 天然与人工合成的C-核苷。

美国德克萨斯大学奥斯汀分校（UT Austin）的刘鸿文教授（点击查看介绍）课题组一直致力于C-核苷类天然产物的生物合成以及相关的酶学机理研究。恶嗪霉素（Oxazinomycin，1）是C-核苷天然产物的一种（图1），具有抗菌以及抗肿瘤活性。除了与其他C-核苷共有的C-糖苷键之外，恶嗪霉素还具有结构上十分特殊的1,3-恶嗪部分，其生物合成过程是以往未知的。近期，该团队成功实现了恶嗪霉素全生物合成的体外重组，并深入研究了酶催化的C-糖苷键与恶嗪环的生成。

图2. C-糖苷键的形成。

研究人员通过对比分析秀多霉素（showdomycin）以及假尿嘧啶核苷（pseudouridine）的C-糖苷酶序列推测ozm基因簇中的C-糖苷酶OzmB可能催化呋喃糖酸与吡啶衍生物（2）间的耦合（图2）。然而，此富电的吡啶衍生物（2）在中性有氧的环境下不稳定，研究人员因而通过合成的方法获得了较为稳定的吡啶盐酸盐并且在无氧的条件下尝试进行糖苷化的酶催化反应。实验结果显示，当反应产物接触到空气时会由无色变为蓝色，并产生二聚物靛蓝（Indochrom）的质谱讯号。研究人员因此认定C-糖苷酶OzmB的催化产物为富电的C-吡啶衍生物核苷（3），只因其极易经由非酶催化氧化形成二聚物而无法被直接表征。进一步的研究证实C-糖苷化的机理是经由酶的甘胺酸残基与呋喃糖酸形成活化的席夫碱中间体，进而被吡啶衍生物亲核进攻形成碳碳键。

图3. 非血红素铁单加酶OzmD的表征。

恶嗪霉素的生物合成中最重要的一步是吡啶环向恶嗪环的氧化重排过程（3->1, 图3），研究发现，该过程仅需要一个酶OzmD的催化。为了揭示这一环重排反应的机理，研究人员先鉴定该反应的副产物是氰根离子，并通过同位素示踪法揭示了氰根离子源于底物的三号位碳及其相连的氮，而被引入恶嗪环中的氧原子来自氧气而并非水（图3）。虽然OzmD属于结构以及特征都是未知的DUF4243蛋白家族，研究人员从纯化后蛋白的颜色以及光谱推测该蛋白可能含有金属辅因子。进一步的滴定实验以及完整蛋白质谱证实OzmD属于非血红素类型的单铁蛋白，并且铁是酶催化过程中不可或缺的重要因子。因为缺乏与OzmD序列相似的蛋白的晶体结构资讯，研究人员利用人工智能（AlphaFold2）预测该蛋白的三维结构并推测其中一个富含组氨酸的部分可能参与了铁的络合（图3）。进一步的，研究人员通过点突变的方式鉴定出四个对于OzmD活性必要的组氨酸残基，其功能可能与催化铁的络合有关。结合之前的同位素示踪结果，研究人员提出了可能的吡啶环向恶嗪环转化的铁催化氧化重排的机理（图4）。

图4. 推测的氧化重排机理

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，美国得克萨斯州大学奥斯汀分校刘鸿文教授课题组的研究生任大安与李渝萱为该文的共同第一作者，刘鸿文教授为该文的通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Characterization of the Oxazinomycin Biosynthetic Pathway Revealing the Key Role of a Nonheme Iron-Dependent Mono-oxygenase

Daan Ren, Yu-Hsuan Lee, Shao-An Wang, and Hung-wen Liu*

J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 10968–10977, DOI: 10.1021/jacs.2c04080

导师介绍

刘鸿文

https://www.x-mol.com/university/faculty/361 

Liu Lab主页链接

https://sites.utexas.edu/liu/