南丹麦大学吴昌柱教授团队Nat. Commun.：基于大肠杆菌化学修饰而成的人工孢子实现高效的界面生物催化

以酶和全细胞为代表的生物催化在高附加值的精细化学品、药物中间体等产品的合成中受到越来越多的关注。尤其是在“碳达峰、碳中和”的大战略下，推进生物催化技术的广泛应用具有重大意义。在实际应用中，受限于生物催化剂的自身特性，其应用只能在水环境中。而有机底物往往水溶性极其有限，这往往便导致整体的空时产率较低。通常的解决方案是引入一种与水互不相溶的有机溶剂组成有机-水两相体系，以此为生物催化剂和底物提供各自适宜的溶剂环境。但两相体系中底物的传递阻碍较大，且两相的界面接触面积有限，导致底物与催化剂的接触机会减少。这些因素导致两相体系无法取得最大的催化效率。

在此背景下，南丹麦大学吴昌柱教授课题组一直致力于打破两相中的物质传递阻碍，增加两相的界面面积，提升生物催化过程的增提效率。为此，一系列的乳液体系被建立起来，通过乳化过程有效提升了界面接触面积，显著提高了催化效率（Bioresour. Technol. 2020, 295, 122221; Chem. Eur. J. 2018, 24, 10966-10970; Adv. Mater. 2011, 23, 5694-5699）。此后，该课题组还通过发展功能性的乳液体系，实现了化学-酶耦联体系的构建以及乳液制备-分离的精准控制（ChemCatChem. 2022, 14, e202101556; Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 8410-8414）。为进一步提高两相催化效率，他们通过修饰化或固定化酶，使酶直接分布在两相的界面上，以此使物质传递阻力达到最低，实现界面生物催化（ChemSusChem. 2020, 13, 6523-6527; Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 13810-13814）。

在这些工作的基础上，该课题组思考如何进一步推进界面生物催化从酶到全细胞的应用，因为相比于传统的酶催化，全细胞催化可以避免酶的纯化分离，这可以有效降低生物催化剂的生产成本。此外，细胞内部组织为酶提供了一个最天然的环境，且细胞膜会给酶提供一定的保护作用，这些都有利于维持酶的催化活性。但细胞在有机溶剂、界面张力、剪切力等环境压力下极易死亡，从而影响内部酶的活性及稳定性。

为了提高全细胞抵御环境压力的能力，吴昌柱教授及其博士后孙志永(目前就职于浙江工业大学)受自然界中细菌孢子可以抵御多种环境压力（紫外光照射及化学试剂毒害）的启发，利用聚多巴胺的良好生物相容性及保护性，包裹大肠杆菌的表面构建人工孢子。该孢子体系可以有效抵御紫外光、高温、有机溶剂、有机-水两相界面张力的影响，维护细菌的代谢活性。同时，其内部可以表达多种酶，并应用于单酶及多酶的界面催化过程（图1）。此外，该孢子可以负载化学催化剂，并成功构建起化学-酶偶联催化体系，进一步丰富了细胞工厂的应用。相关工作近日发表于Nature Communications。

图1. 包裹大肠杆菌构建人工孢子应用于界面生物催化的示意图。图片来源：Nat. Commun.

人工孢子的表征

作者首先利用透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对人工孢子进行了直观的表征，并以原始的大肠杆菌作为对照。在TEM图像中，可以看到细胞外的包覆层（图2e,2f）,而原始细菌外则没有。SEM表征中，可以直观看到颗粒状的包裹物和粗糙的表面（图2g）,而原始细菌的表面相对光滑。综合SEM和TEM，人工孢子的形成得到了有力的证实。

图2. 人工孢子的表征。b-d:原始细菌。e-g:人工孢子。图片来源：Nat. Commun.

生物相容性表征

之后，我们对包裹过程的生物相容性进行了验证。在细菌活/死实验中，通过与原始细菌对比（图3a），可以看到人工孢子有着较高的存活率（图3b,绿色）。此外，人工孢子的繁殖能力也与原始细菌相当（图3c）。

图3.生物相容性评价。a: 原始细菌。b:人工孢子。c:生长曲线。图片来源：Nat. Commun.

保护性

为了研究人工孢子对各种环境压力的抵御能力，我们分别施加紫外光、温度、有机溶剂以及有机-水两相界面张力等外界压力。在细菌的死/活实验以及酶活稳定性实验中，人工孢子的表现均大大优于原始细菌（图4）。例如，在紫外光照射下，原始细菌几乎全部失去活性，而人工孢子则有超过85%的存活率（图4b,4c）。此外，人工孢子中的酶活性也几乎是原始细菌的2倍（图4d）。在其他压力环境下，人工孢子也有着相似的存活率和酶活性。

图4.保护性评价。a-d: 原始细菌和人工孢子在紫外光照射下存活率以及酶活性。e-h: 原始细菌和人工孢子在两相界面处存活率以及酶活性。图片来源：Nat. Commun.

乳液表征

此后，我们通过对包裹材料组分的优化，成功构建了人工孢子稳定的皮克林乳液体系。利用两种不同的染料分别标记有机相与水相，证实我们得到了水包油型乳液（图5d）。此外，通过表达绿色荧光蛋白于细胞内，可以看到人工孢子分布于有机-水两相的界面上（图5f, 5g），该发现也通过SEM得到了直观的证实（图5h）。

图5.人工孢子稳定乳液的研究。图片来源：Nat. Commun.

单步界面生物催化反应研究

我们首先表达酯酶CalB于大肠杆菌中，随后进行表面包裹，构建人工孢子。通过优化人工孢子表面亲疏水性、乳液体系的有机相-水相比例及人工孢子用量，该乳液体系的催化效率远高于其他两组对照试验（图6c）。此外，该人工孢子在重复多次利用的情况下，仍保持着较好的活性与催化效率（图6d）。由于大肠杆菌是一种广泛适用的酶表达平台，我们又在其他两种酶体系中进行了界面催化的拓展，同样显示出远远优于对照试验的结果（图6f,6h）。值得注意的是，由于人工孢子始终保持着代谢活性，使其在涉及辅酶再生的反应中，可以依靠自身的代谢路径完成辅酶再生而无需其他辅助。这将大大降低反应体系的复杂性和催化过程的成本，显示了该体系独特的应用优势。 

图6.单步酶催化反应的研究。a-d:基于脂肪酶CalB的乳液体系优化、对比及重复利用。e-f:酶BAL的界面催化研究。g-h:酶ADH-a的界面催化的研究。图片来源：Nat. Commun.

多酶界面生物催化的研究

在单酶反应证实过可行性后，我们进一步将反应体系拓展到多酶催化。为此，我们以2种多酶耦联催化反应为研究对象，如图7所示，证明了在界面催化体系中的反应效率都远高于对照实验。

图7.多酶催化反应的研究。a-b:基于ADH-ht和CalB的多酶界面催化。c-d: 基于ADH-ht和BAL的多酶界面催化。图片来源：Nat. Commun.

化学-酶耦联界面生物催化的研究

随后，我们进一步以人工孢子为载体，负载了金属催化剂钯，并通过TEM进行了钯纳米颗粒的分布表征（图8b,8c）。值得注意的是，金属催化剂的负载并没有影响人工孢子的繁殖能力（图8d）和乳化能力（图8f）。此外，我们设计了化学-酶偶联催化体系（图8g），并进一步证明了界面催化体系的优越性（图8h）。

图8. 化学-酶耦联催化反应的研究。a-d:负载钯纳米颗粒的人工孢子表征及其生长曲线。e-h: 负载钯纳米颗粒的人工孢子的乳液研究及其界面化学-酶耦联催化研究。图片来源：Nat. Commun.

吴昌柱教授课题组利用生物相容性的聚多巴胺包裹大肠杆菌，构建了可以抵御环境压力的人工孢子，并通过在其内部表达多种不同的酶，使其作为细胞工厂应用于单酶、多酶以及化学-酶耦联的界面生物催化过程。鉴于该细胞工厂的通用性以及化学催化剂的多样性，可以展望，以人工孢子为基础构建的界面催化体系将为二者的结合提供更多的可能性，并有望应用于解决合成工业上的难题。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Artificially sporulated Escherichia coli cells as a robust cell factory for interfacial biocatalysis

Zhiyong Sun, René Hübner, Jian Li & Changzhu Wu 

Nat. Commun., 2022, 13, 3142, DOI: 10.1038/s41467-022-30915-2 

课题组介绍

南丹麦大学化学系的吴昌柱教授课题组致力于酶催化及绿色化学的研究；其研究重点是通过对酶及细胞的化学修饰获得new-to-nature的生物催化应用。详情请参见：https://www.wugroup.sdu.dk/ 

希望对我们组研究方向感兴趣的研究人员与我们取得联系。我们课题组现在资金充足、年轻、有活力，具有较好的发展前景；目前我们招聘多个全奖的博士和博士后位置；丹麦的博士生、博士后的质量和待遇享誉全球。

孙志永博士目前就职于浙江工业大学生物工程学院，任独立PI。课题组长期招募有机合成、生物催化或自组装等研究背景的青年教师及博士后，欢迎有兴趣的研究人员与我们联系。详见：http://www.homepage.zjut.edu.cn/szy/cbb/ 

孙志永

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