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高效色谱微柱大规模制造技术

基于酶解肽段进行蛋白测序的鸟枪法是现代蛋白组学研究的经典方法,其中nanoLC-MS(纳流液相色谱-质谱联用)的技术路线已成为标准的蛋白组学工作流。面向复杂微量的生物样本,纳流液相色谱具有高灵敏、高分辨的显著优势,而其核心——纳流液相色谱柱——对复杂肽段的分辨与鉴定起着重要的支撑作用。随着现代生物组学(蛋白质组、代谢组)的发展,对核心的分离工具——色谱微柱的分辨率、重新性和稳定性提出了更高的要求。高质量的色谱微柱将大大推动组学研究的标准化和工业化,使得分析方法和组学数据可在全球实验室间实现自由转移和平行比对,这对于大规模组学(如人群队列)、临床医学(如体外诊断方法与试剂盒开发)和生物药工业(如高通量筛查候选药物分子)都具有重要的实际意义。


最近,厦门大学张博点击查看介绍)课题组开发了一种基于离心力作用并行高通量制备毛细管色谱柱的方法。这一新型的色谱柱技术可在1分钟内完成色谱柱的填充,在一个工作日内实现了2886支色谱柱的高通量、大规模制备。所获得的色谱柱,相较于传统高压匀浆填充法制备的色谱柱,具有显著提升的色谱柱效(37-40%)和更加优越的动力学极限,以及优良的柱间高重现性(保留时间RSD=2%,50支柱)。在蛋白质组分析中,基于离心填充色谱柱实现了~5300个HeLa蛋白的鉴定,且探针肽段保留时间的柱间与次间重现性达到了RSD=0.94%。这一新型的色谱微柱技术可以支持高质量色谱微柱的一次性、大规模、低成本使用,这对于海量微尺度样本(如单细胞)和易交叉污染/易造成色谱柱污染的临床样本(血浆、尿液)的大规模生化分离分析提供了一种新的色谱工具。


在该工作中,采用本实验室前期开发的单颗粒柱塞技术 (Anal. Chim. Acta2014852, 267-273; J. Chromatogr. A20141325, 109-114),基于实验室常见易得的离心管耗材和商品化离心机构建了简单有效的制备平台(图1),通过离心力驱动填料匀浆液,使其均匀接续地进入毛细管柱中,形成紧密堆积的色谱柱床。这种基于离心力的制柱技术简单且高效,能在低至一分钟时间内完成多根液相色谱柱的同步填充,有效地避免了填料匀浆在长时间的填充过程中团聚沉降;同时快速的填充过程极大提高了制柱通量,单日可成功制备超过2000支色谱柱,在制柱质量和效率上均凸显出传统高压匀浆填充法无法比拟的优势,这也为海量复杂生物样本的高分辨分离分析提供了强有力的工具。

图1. 示意图(A)展示所开发离心填充装置各个部件和装配顺序。实物图(B, C, D)分别展示了带有单颗粒柱塞的离心填充单元,以及 (E) 50根填充制备的nanoLC色谱柱。


在该项研究中,首先通过离心填充条件的探索和优化,明确较低的离心转速(2000 rpm)即可保证匀浆储液中填料顺利转移至毛细柱管内,该转速条件下制得填充柱均具最高柱效(N=115000/m,5 μm),色谱柱床的荧光成像表征(图2)显示均一的填充床微结构。择定最优离心条件后通过比较离心填充和高压匀浆填充制备柱的van Deemter曲线和动力学性能极限(图3 A, B),显示离心填充柱在A项和C项上具备的优势,整个流速范围内保持稳定的高柱效,以及优良的动力学性能。通过零死体积二通耦合,即可将8 cm离心填充短柱灵活地扩增至16、24 和32 cm柱长,等比增加的塔板数表明这种离心填充柱优良的一致性和可扩展性(图3 C, D)。此外,对于批量制备的50支色谱柱进行评价,色谱图显示通过该法批量制造的色谱柱具有优异柱间重现性(图4)。

图2. 激光共聚焦扫描显微镜表征柱床形貌3D图像:(A)传统高压匀浆法填充的色谱柱,(B)基于离心填充法制备的色谱柱。


图3. 离心填充和高压匀浆填充制备的毛细管柱(A)van Deemter 曲线,(B)动力学极限,(C)离心串联长柱塔板数随串联数的变化及(D)实物图。色谱柱:8 cm x 100 μm i.d.,填充 Ascentis Express C18,流动相为60% ACN;Pmax=40 MPa。


图4. 在50支离心填充柱分离烷基苯混合物的色谱图。色谱柱:8 cm x 100 μm i.d.,填充 Ascentis Express C18,流动相为60% ACN;分析物从左至右分别为硫脲、甲苯、乙苯、丙苯和丁苯。


在蛋白质组学分析中,以HeLa细胞蛋白酶解物为样品,采用三根8 cm nanoLC柱进行酶解物分离,可鉴定蛋白数达到5300个,且柱间和次间运行结果高度重现(图5):95.9%的肽段保留时间偏差小于2%,展现出稳定和高效的蛋白组学分辨本领,对推动蛋白质组学分析的标准化具有重要意义。


这一简单、快速、稳健的离心填充技术可以实现高效色谱微柱的高通量制备,为生物组学分析的标准化和大规模生化分析项目提供了高效、稳定、可靠的解决方案。其高柱效和低成本的特性可以支持高质量色谱微柱的规模化、一次性使用,这为单细胞组学和海量样本的高通量筛查分析提供了一种理想的分离工具。

图5. 三根离心填充柱,分别重复分离检测三次的HeLa细胞蛋白酶解物谱图:(A)nanoLC-MS 的色谱图和(B)所有特征肽段的保留时间分布。色谱柱:8 cm x 100 μm i.d.,填充Hypersil BDS C18,3 μm,120 Å。


该工作近日发表于Analytical Chemistry,厦门大学已毕业博士生刘娅为论文的第一作者,张博副教授为通讯作者,中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心王小娟朱旭东博士和厦门医学院罗联忠教授提供了技术支持。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Mass fabrication of capillary columns based on centrifugal packing

Ya Liu, Hanrong Wen, Shiyi Chen, Xiaojuan Wang, Xudong Zhu, Lianzhong Luo, Xiaofei Wang and Bo Zhang*

Anal. Chem., 202294, 8126–8131, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c00442


导师介绍

张博

https://www.x-mol.com/university/faculty/14163 


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