JACS：大观霉素生物合成途径中二氧六环的形成涉及Twitch自由基SAM异构酶进化而来的脱氢酶SpeY

自由基SAM酶催化的大多数反应都涉及SAM的还原与自由基介导的底物转化相耦合，这些酶的活性中心包含一个催化型的[Fe₄S₄]_rad参与SAM的还原裂解而触发反应。含有一个或者两个辅助[Fe₄S₄]_aux的自由基SAM酶，被称为SPASM/Twitch自由基SAM酶，它们可以催化氧化还原中性（异构化反应）和氧化（脱氢反应）的反应。近年来，因为辅助的[Fe₄S₄]簇可能参与催化循环中自由基中间体的氧化还原，而引起了特别多的关注。

近日，J. Am. Chem. Soc.杂志刊发了德克萨斯大学奥斯汀分校刘鸿文教授和中科院深圳先进技术研究院周佳海研究员团队合作的最新工作，该文章结合化学合成、化学生物学和结构生物学的方法，深入研究了大观霉素生物合成途径中的Twitch自由基SAM酶SpeY，该酶可以催化(2'R,3'S)-tetrahydrospectinomycin的C2'位发生脱氢反应生成中间体(3'S)-dihydrospectinomycin，参与大观霉素二氧六环的形成。该反应是由自由基介导的，反应的起始是SAM还原裂解生成的5'-脱氧腺苷自由基攫取底物C2'位的H原子。SpeY•SAM•底物的复合物晶体结构（分辨率1.90 Å）显示183位的Sγ/Oγ中心与底物C2'位以及SAM C5'几乎在一条直线上，形成共线矩阵，将其突变成半胱氨酸后，SpeY会转化为相应的C2'羟基异构酶，这与潮霉素B生物合成途径中的Twitch自由基SAM异构酶HygY的功能相反。系统发育分析表明，推测含有同源半胱氨酸残基的Twitch自由基SAM差向异构酶有一个相对较新的进化分支，可以转变为脱氢酶。

图1. (A) HygY和HygY-C183A分别催化异构化反应和脱氢反应; (B) 大观霉素由actinamine (7) 和actinospectose (8) 组成

2021年9月刘鸿文教授团队曾报道Twitch家族的自由基SAM酶HygY，该酶在潮霉素B的生物合成中催化半乳糖胺C2'位羟基的异构化，当Cys183突变为Ala时，HygY在C2'位的异构活性转变为C2'位的脱氢活性（图1A）。由于SpeY与HygY的序列一致度有50%，将其Ser183突变为Cys，SpeY在C2'位的脱氢活性转变为异构活性，这两种酶呈现出功能相反的现象，说明氧化还原中性（异构化反应）和氧化（脱氢反应）之间存在进化关系。

图2. (A) 假设先形成糖苷键再形成C2'位羰基生成中间体5; (B, C) (2'S)-21的合成路线

为了探究大观霉素生物合成中二氧六环的形成机制，刘教授团队首先对大观霉素可能的生物合成途径尝试两种假设：一种认为大观霉素的合成是先形成C2'位羰基再形成糖苷键，推测actinamine（7）和TDP-2'-keto-actinospectose（14）是大观霉素的反应前体，两者可以通过糖基转移酶SpcG耦合生成大观霉素（图1B）；另一种是先形成糖苷键再形成C2'位羰基生成中间体5，随后发生自发的半缩酮反应生成大观霉素（图2A）。于是，他们先用酶促法合成中间产物TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose (17)，再将17与SpeY、SpeI或者SpeH反应，但是反应中并没有底物的消耗，也没有产物的生成，说明第一种假设不成立。接着，他们用化学法合成(2'S)-21，LC-MS分析反应产物发现主产物(2'S)-21没有消耗，而副产物30有明显的消耗。其次，为了确定SpeY的底物特异性，刘教授团队合成了副产物30 C2'和C3'两个手性碳的四个非对映异构体，最终确定了SpeY催化(2′R,3′S)-30 C2'羟基发生脱氢反应生成37，随后发生自发的半缩酮反应形成二氧六环（(3′S)-31）。然后，他们利用同位素标记的底物类似物，证明SAM裂解产生的5'dAdo•对底物C2'位H的立体选择性。接着将与辅助的[Fe₄S₄]_aux配位的四个半胱氨酸突变成丙氨酸后，SpeY活性消失，说明辅助的[Fe₄S₄]_aux对SpeY催化脱氢反应的重要性。

图3. SpeY•SAM•[(2′R,3′S)-30]的晶体结构

为了进一步揭示SpeY的催化机理，周佳海团队分别解析了SpeY•SAM、SpeY•SAM•[(2′R,3′S)-30]和SpeY•SAM•37复合物的晶体结构。底物呈低能的椅式构象，稳定地结合在活性口袋，大部分官能团与周围残基存在氢键作用。SAM C5'位与底物C2'位距离是4.0 Å，再次验证5'dAdo•会攫取底物C2'位的氢生成底物自由基来触发后续的化学反应（图3）。同时研究团队还发现突变体SpeY-S183C可以催化底物(2′R,3′S)-30 C2'位羟基发生异构化生成(2′S,3′S)-30，晶体结构显示183位Ser的羟基、底物的C2'位以及SAM的C5'位几乎在一条直线上（图4），说明生成C2'位的底物自由基很容易攫取Cys巯基上的H，完成异构化，随后溶剂体系中的H⁺和电子经[Fe₄S₄]_aux的传递猝灭巯基上的硫自由基。

图4. SpeY-S183C的异构化功能

综上所述，研究者最终确定SpeY属于Twitch自由基SAM脱氢酶，可以催化假二糖(2′R,3′S)-30 C2'位的羟基发生脱氢反应，突变体SpeY-S183C可以催化底物C2'位的羟基发生异构化，这也说明氧化（脱氢反应）与氧化还原中性（异构化反应）之间存在进化关系。SpeY及其同源结构也代表自由基SAM twitch家族中的一个酶学分支，这类酶可以催化异构化或者其他氧化还原中性的转化。

该研究工作是刘鸿文团队与周佳海团队共同完成，德克萨斯大学奥斯汀分校的博士生张佳伟与西北农林科技大学/中科院上海有机所联合培养博士生候雪丽为该文的共同第一作者。刘鸿文教授和中科院深圳先进技术研究院/中科院上海有机所周佳海研究员为该文的共同通讯作者。

感谢上海市技术委员会和中国科学院战略性先导科技专项基金项目对该工作的支持，感谢上海光源的工作人员在收集数据时提供的帮助。

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Dioxane Bridge Formation during the Biosynthesis of Spectinomycin Involves a Twitch Radical S-Adenosyl Methionine Dehydrogenase That May Have Evolved from an Epimerase

Jiawei Zhang, Xueli Hou, Zhang Chen, Yeonjin Ko, Mark W. Ruszczycky, Yutian Chen, Jiahai Zhou*, and Hung-wen Liu*

J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 9910–9919, DOI: 10.1021/jacs.2c02676

Liu Lab主页链接： 

https://sites.utexas.edu/liu/    

Zhou Lab主页链接: 

http://isynbio.siat.ac.cn/zhoulab/