烟熏的葡萄，酿不出美酒

近年来，由于天气高温和干旱，澳大利亚频频发生大面积森林火灾。肆虐的山火造成了当地人员、财产的重大损失，大火形成的浓烟产生大量空气污染物，导致空气质量下降，严重影响居民健康。除此之外，森林火灾还产生了另外一个让人有些意想不到的后果——当地葡萄酒的品质下降。澳洲葡萄酒研究所（AWRI）发现：火灾区域的葡萄园，即使顽强幸存下来，当季收获的葡萄所酿的酒也会因烟熏而影响口感，产生“灰烬味（ashy）”、“苦涩（bitter）”、“烟熏味（smoky）”等拉低品质的味道。

然而，这类依靠品酒师评判的口感并不能与分析化学数据关联，难以定量分析葡萄酒品质的变化。近年来，美国加利福尼亚州、俄勒冈州等地区的葡萄园也受到森林火灾的侵害，这使得加州圣克鲁兹大学的研究人员开始着手研究森林火灾对葡萄酒品质的影响，他们试图通过火灾地区不同时间、种植区域、葡萄品质、后处理方式等因素比较，结合分析化学技术进行研究（图1）。

图1. 森林火灾对葡萄酒品质影响的定量研究。图片来源：J. Nat. Prod.

以往的研究发现，树木燃烧产生的烟雾中含有超过500种挥发性化合物，已有34种挥发性酚类化合物被鉴定出来。森林火灾后，某些挥发酚类化合物能够通过葡萄表皮蜡质角质层快速扩散到果肉层，积累于果实的酚类化合物往往无色无味，经尿苷二磷酸糖基转移酶（UGDTs）催化转化为酚二糖苷类（PDs）化合物。基于这些研究成果，他们设计实验方案，选择PDs作为标志物，同时采用商业购买的氘代同系物作为对照标准品，优化高压液相色谱出峰时间，采用三级四级质谱仪测定PDs在葡萄汁和葡萄酒中的浓度（图2）。

图2. 检测葡萄样品中PDs的工作流程。图片来源：J. Nat. Prod.

他们重点研究的葡萄品种是赤霞珠（Cabernet Sauvignon），同时也包括梅洛（Merlot）、品丽珠（Cabernet Franc）、马尔贝克（Malbec）、黑比诺（Pinot noir）、西拉（Syrah）、歌海娜（Grenache）和仙粉黛（Zinfandel）。他们基于澳洲葡萄酒研究所的前期研究成果，以2017-2021年美国加利福尼亚州和俄勒冈州靠近或远离山火的葡萄园所产葡萄汁和葡萄酒为研究对象，通过高效液相-串联质谱（HPLC-MS/MS）定量分析样品所含的6种PDs（化合物1-6，图3）。研究项目又称为为圣克鲁兹行动（SCC），包括分析比较：（1）澳洲葡萄酒研究中心针对烟熏和非烟熏来源的白、红葡萄酒收集的相关数据，（2）加拿大奥克纳根谷葡萄园数据，（3）2018年，美国加州大学收集的纳帕县和莱克县山火附近葡萄园赤霞珠的样品数据。

图3. 标志物的结构、名称和氘代原子的位置。图片来源：J. Nat. Prod.

他们分别分析了2018年、2021年受不同程度山火影响的14个加州葡萄园（莱克县和纳帕县）的赤霞珠葡萄汁和葡萄酒，并且与澳洲葡萄酒研究所的资料进行了比较分析。他们根据样品检测到的PDs浓度（单位是十亿分之一，ppb），将受烟雾侵袭的严重程度分为以下几类：（a）浓度< 6 ppb为不受烟雾侵袭（或基线水平），（b）浓度6-30 ppb 为轻度，（c）浓度31-100 ppb 为中度，（d）浓度101-200 ppb 为显著，（e）浓度为201-300 ppb 为偏高，（f）浓度301-400 ppb 为大量，（g）浓度> 400 ppb 为严重。结果显示，2018年有1个葡萄园不受侵袭，1个葡萄园受轻度侵袭，8个葡萄园受中度侵袭，剩余4个受偏高或大量侵袭。有趣的是，这一结果与品酒师的感官评价并不一致（图4）。

图4. 量化分析2018年加州葡萄园（莱克县和纳帕县）赤霞珠受山火影响所含PDs变化情况。图片来源：J. Nat. Prod.

在2021年的数据研究中，他们着重分析了多个葡萄园赤霞珠转色、收获、浸渍、发酵处理后PDs含量。结果显示，1个葡萄园不受侵袭，12个葡萄园受轻度侵袭，1个葡萄园受中度侵袭。这说明所分析的葡萄园受野火侵袭影响较小，也与2021年加州野火规模较小的情况相符。研究还发现，样品中的PDs在葡萄果实和葡萄酒中含量差别较小，说明PDs在样品发酵前后是稳定的（图5）。

图5. 量化分析2021年加州葡萄园（莱克县和纳帕县）赤霞珠受山火影响所含PDs变化情况。图片来源：J. Nat. Prod.

他们研究了PDs在红酒样品中的稳定性，数据分析显示PDs可以在红酒中稳定存在若干年。随后，他们以时间轴为导向，定量分析了多年来14个加州葡萄园（莱克县和纳帕县）的红酒烟熏基线和偏高水平的PDs。结果显示6种PDs标志物中，化合物4和6只有在样品受烟雾从偏高到严重侵袭时才能检测到浓度信息，检测灵敏度较低。

他们还量化分析了2021年赤霞珠和仙粉黛葡萄酒酿造时PDs的积累情况（图6），以及加州和俄勒冈州多个葡萄酒种植区的黑比诺葡萄酒所含PDs变化。结果显示，化合物4和6浓度在检测体系中的作用甚微，在中度烟熏的葡萄发酵过程中PDs浓度变化不大。加州葡萄所含中等或高浓度的PDs在酿酒第一步中保持稳定，相比于俄勒冈州，烟熏对加州种植区的黑比诺葡萄酒影响更普遍。

图6. 2021年赤霞珠和仙粉黛葡萄酒酿造时PDs的积累情况。图片来源：J. Nat. Prod.

最后，他们定量分析了2018-2021年6种不同品种葡萄酒所含PDs情况，并重新评估了PDs作为分子标记物在红酒中的重要性。结果显示，在基线（空白）和烟熏影响的葡萄酒中相对PDs浓度差异受化合物2和5的变化影响最大，而受3和6的影响要低很多，在评估烟熏葡萄酒品质缺陷时直接检测PDs比测定游离酚或总酚更有效，值得注意的是，在加州和俄勒冈州红酒PDs分析中，他们还发现了对映异构体的含量变化（图7）。

图7. 4个年份、6种葡萄品种中量化分析化合物1-6。图片来源：J. Nat. Prod.

总之，以上研究结果表明，酚二糖苷类化合物在陈酿了2.5年的葡萄酒中是稳定的，葡萄品种、品种无性系和森林火灾烟雾强度与酚二糖苷类化合物含量之间存在相关性。分析成对样本（瓶装葡萄酒与暴露于烟熏中的葡萄）可以提供诊断性代谢组学数据。研究团队也客观评估了实验中使用PDs的局限性，尤其是化合物4和6作为生物标志物不太给力，需要在未来研究中寻找更好的替代者。生物标志物中的非对映异构体在以后的研究中应该得到重视，由于质谱在分子结构解析中存在局限性，未来的研究中要考虑能够提供更多结构信息的研究方法和手段。

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Natural Product Phenolic Diglycosides Created from Wildfires, Defining Their Impact on California and Oregon Grapes and Wines

Phillip Crews*, Paul Dorenbach, Gabriella Amberchan, Ryan F. Keiffer, Itzel Lizama-Chamu, Travis C. Ruthenburg, Erin P. McCauley, and Glenn McGourty

J. Nat. Prod., 2022, 85, 547–561, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.2c00028

（本文由天生西南供稿）