浙江大学唐龙华等Sci. Adv.：利用隧穿结器件实现单分子蛋白质长时电导测量

蛋白质是生物体中的必要组成成分，是生命活动的主要承担者。而电子在蛋白质中的输运行为与能量转换、信号传导等重要生命过程息息相关。例如，在真核生物呼吸链反应、植物光合作用和细菌胞外电子传输等生物过程中，蛋白质起到了电子传递链的天然媒介体作用。近年来，随着高精度表征工具的发展，特别是冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的成熟和运用，科学家们可以便捷地获取高分辨率的蛋白结构信息，可以在溶液中观察生物大分子的构象状态变化（毫秒级），为生理、药物和生物材料的研究开发提供基础生物学信息。然而，这些信息的获取仍存在多种限制，例如结晶过程非常耗时，而且通常只能用于单一纯化的蛋白（单体或二聚体），且不适用于细胞环境中的蛋白质表征，无法提供蛋白质实时、原位的电子输运信息。

单分子光电子器件是基于单个分子或分子阵列构建的光电子功能单元，结合单分子内部的光电转换、电荷传递等物化过程进行性质调控，实现与宏观器件相同的功能。例如，将蛋白质与生物光电子器件相结合，构造分子尺度的生物电子或光电子器件，有望实现对单分子光电子特性以及动力学过程观察，相对于传统的系综分析法（ensemble-average）可更深入理解和认识单个蛋白质分子的本征特性。近年来人们一直在寻找可靠的方法，将单分子蛋白质与生物电子器件相结合，从而更好地理解和操纵单分子蛋白质介导的电子传输过程。结合隧穿过程的单分子电学测量技术依赖于量子力学隧穿效应（quantum mechanical tunneling，QMT），其核心是电子在纳米电极对间隙（间距一般小于5纳米）的电子输运以及分子引起的隧穿电流的变化。它可以提供原子尺度的空间分辨率，并且反映分析物的性质和特征 ^[1]。单个蛋白质分子与量子隧穿器件结合，实现了在固定隧穿间隙中捕获和分析单个蛋白质，提供了一种强大且新颖的方法来实时测量蛋白质的构象，为构建新型单分子传感器夯实了基础，为进一步测序平台的建立展现了良好前景。

但现有技术大多数局限于干燥状态的具含氧化还原电对的一类特定蛋白，难以在蛋白质所必需的溶液环境下稳定测量与工作。对于电化学惰性（一般指不含金属离子电化学活性中心）的蛋白，由于其最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）之间的能级差较大，电子无法跃迁，通常被认为是不良导体。2018年，亚利桑那州立大学Stuart Lindsay团队利用电化学扫描隧道显微镜（EC-STM）首次在实验室观测到了几种非金属蛋白在特定条件下具有超常的电荷传输能力，后续对其电导机制和功能应用展开了系列研究 ^[2,3]。他们发现，利用蛋白质上的两个特定结合位点，形成基于单个蛋白质分子的电子回路，可获得蛋白质的高电导信号。然而，EC-STM的工作原理使得难以构建长时间稳定的金属-生物分子-金属结，无法满足对蛋白质长时间的稳定测量，阻碍了对蛋白质电子输运本质的进一步理解，限制了该类型蛋白电子器件的功能应用。

浙江大学现代光学仪器国家重点实验室的唐龙华（点击查看介绍）团队致力于单分子光电子器件、时空分辨测量技术与仪器研究，前期与英国帝国理工学院Joshua B. Edel教授组联合研发了一种基于临近双纳米孔的隧穿结器件，其集成于百纳米大小的针尖上，电极间距在亚纳米~3纳米范围内可调。该隧穿结器件无需STM等技术所需的导电衬底，制作工艺简单，且在溶液相中保持长时间稳定。作者进一步利用单核苷酸、DNA等模型评估了隧穿电学测量性能，最为重要的是，证明了非金属核心的蛋白质在隧穿尺度电极下仍可获得高信噪比的电学信号。此外，该器件兼容交流介电泳操控技术（DEP），可以将非均匀电场下的分子有效富集，实现了超低浓度生物分子的隧穿电学测量，灵敏度可达亚飞摩尔(< 10^-15 mol/L)级别。该部分成果以论文形式发表于Nature Communications期刊 ^[4][5]。

图1. 结合介电泳分子操控的隧穿结器件与单分子超低浓度电学测量。图片来源：Nat. Commun. ^[4][5]

近日，该团队利用该固定间隙隧穿结器件，构造了长时间稳定的蛋白质单分子结，并借助低噪音、高信噪比的电学测量系统，首次实现了对单蛋白分子的长时间动态电导测量，获得了偏压依赖的，分辨率达到微秒级别的单蛋白电导信息，进一步探究了电场与蛋白电导变化的关系（图2）。作者首先对隧穿结电极表面进行硫醇化生物素修饰，然后滴定加入蛋白质分子，实时监控隧穿电流信号变化，筛选获得包含单分子蛋白的电学器件，然后进行长时（>2小时）电学表征测量，有力证明了分子结的稳定性。

图2. 基于隧穿结的单体蛋白质器件示意图。图片来源：Sci. Adv.

为了形成稳定的蛋白质单分子结，作者选用了非氧化还原活性的四聚体链霉亲和素作为研究对象，它具有四个与生物素的结合位点。首先，隧穿结器件通过硫醇化生物素进行功能化后，一对隧穿电极上的生物素可分别用作与链霉亲和素结合的锚。之后，在 pH 7.4 的 1 mM 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 中以 100 mV 的施加偏压测量隧道电流随时间的变化，实时监测单个蛋白质结的形成。当链霉亲和素结合时，可以很快观察到隧道电流的突然上升，然后在两个水平之间出现稳定的随机电学信号震荡。随后在连续扫描的偏压下进行I-V测量，从而研究蛋白质连接的电学特性。在蛋白质的I-V曲线下，可以看到显著的电流跳变，这进一步揭示了蛋白质介导的电子传输特性。

图3. 单分子蛋白隧穿结制备与电学表征。图片来源：Sci. Adv.

此外，通过对照试验证实了链霉亲和素四聚体与功能化电极之间存在特异性相互作用。在不同的偏压条件下进行了实时电流测量，证明了蛋白质电导对偏压具有依赖性，呈正相关。同时，在不同偏置电压条件下的长时间测量，所有电流信号都表现出一致的振荡特性，证明了蛋白质连接的稳定性及其电学特性的再现性（图3）。

图4. 偏压依赖的蛋白电导变化情况。图片来源：Sci. Adv.

总结

此研究提出了一种基于量子隧穿结器件的单体蛋白分子结，实现了溶液环境中单体蛋白质的长时电导测量，观察到了偏压依赖的蛋白电导特性，剖析了电场对蛋白构象和电导的可能影响。研究表明，该隧穿结器件可为研究单个蛋白质分子的电子输运机制提供了有效的工具，并进一步用于揭示蛋白质与生物过程所息息相关的实时构象动态信息，丰富蛋白质结构和功能的调控手段，促进生化传感、生物光电子器件等领域的功能应用。

相关结果近期发表在Science Advances 上，浙江大学光电科学与工程学院唐龙华是论文的第一作者和通讯作者，另两位通讯作者是帝国理工学院的Aleksandar P. Ivanov 教授和 Joshua B. Edel教授。合作者还包括帝国理工学院的任壬博士，亚利桑那州立大学Stuart Lindsay教授和张斌田博士（现为南方科技大学助理教授）。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划和浙江省杰青等项目的支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Measuring conductance switching in single proteins using quantum tunneling

Longhua Tang*, Long Yi, Tao Jiang, Ren Ren, Binoy Paulose Nadappuram, Bintian Zhang, Jian Wu, Xu Liu, Stuart Lindsay, Aleksandar P. Ivanov*, Joshua B. Edel*

Sci. Adv., 2022, DOI: 10.1126/sciadv.abm8149

导师介绍

唐龙华

https://www.x-mol.com/university/faculty/70392 

参考文献

1. M. Di Ventra,M. Taniguchi. Decoding DNA, RNA and Peptides with Quantum Tunnelling. Nat. Nanotechnol. 11, 117-126 (2016).

2. B. Zhang, W. Song, P. Pang, H. Lai, Q. Chen, P. Zhang,S. Lindsay. Role of Contacts in Long-Range Protein Conductance. Proceedings of the National Academy of Sciences 116, 5886-5891 (2019)

3. S. Lindsay. Ubiquitous Electron Transport in Non-Electron Transfer Proteins. Life 10, 72 (2020).

4. L. Tang, B. P. Nadappuram, P. Cadinu, Z. Zhao, L. Xue, L. Yi, R. Ren, J. Wang, A. P. Ivanov,J. B. Edel. Combined Quantum Tunnelling and Dielectrophoretic Trapping for Molecular Analysis at Ultra-Low Analyte Concentrations. Nat. Commun. 12, 913 (2021)

5. 浙江大学唐龙华等Nat. Commun.：结合介电泳捕获的量子隧穿传感技术实现超低浓度的单分子检测

https://www.x-mol.com/news/521229