Methyldehydrofosmidomycin的生物合成机制：利用烯烃化反应延长碳链

非血红素铁依赖酶（Fe/2OG）被广泛用于碳氢键的直接官能团化，利用该策略可以实现天然产物的结构多样化。据报道，非血红素铁依赖酶可以实现碳氢键的羟基化，环氧化和卤化反应。近年来，北卡州立大学的Wei-chen Chang课题组发展了一系列非血红素铁依赖酶催化反应并对其机理展开研究（异腈化，ACS Catal., 2022, 12, 2270–2279; 环丙烷化，Angew. Chem. Int. Ed., 2022, 61, e202113189; 碳碳键形成, PNAS, 2022, 119, e2113770119等）。

最近，该课题组报道了Methyldehydrofosmidomycin的生物合成机制。作者发现，非血红素铁依赖酶DfmD可以催化碳碳双键形成，碳链延长，以及去甲基化反应，该研究展示了三甲基-2-氨基乙基磷酸转化为Methyldehydrofosmidomycin的机制。作者对反应中的活性物种进行表征，并使用同位素探针研究反应途径和机理。这些结果表明DfmD催化反应实际包含两个过程，其中第一步反应采用Fe(IV)-oxo启动碳碳双键形成，随后烯烃作为自由基受体促使碳碳单键形成并伴随着碳氮键断裂完成烷基链延伸和去甲基化。这项工作通过探索金属酶催化碳碳键形成的新机制，扩展了非血红素铁依赖酶（Fe/2OG）的反应库。

图1.（左）DfmD催化反应的LC-MS 分析；（右）使用³¹P NMR跟踪DfmD催化反应

基于底物1和中间体2的结构，作者认为DfmD催化的反应涉及四电子氧化过程。为了探究反应途径，作者首先利用大肠杆菌异源表达得到DfmD，随后展开体外测试研究该反应进程。如图1所示，底物1消耗的同时可以观察到产物3的生成。此外，还检测到一个m/z值为-2 Da的未知化合物[m/z 168.1→166.1]，作者认为这可能是在限制2OG条件下产生的中间体。利用³¹P核磁实验追踪DfmD催化反应发现化学位移1.9 ppm附近出现新的信号，作者认为该核磁信号可能与m/z值为166.1的峰有关。

图2. 使用NMR和同位素标记的底物类似物原位表征DfmD催化反应的中间体

为了进一步验证该中间体结构，作者设计合成了³¹C标记的底物用作机理探针来研究反应途径并阐明其结构。如图2所示，化学位移126.5 ppm处的峰裂分为dd，耦合常数为153和73 Hz，较大的耦合为C₁-P耦合，而较小的耦合为C-C耦合。化学位移在143.4 ppm也显示为dd峰，耦合常数分别为73(C-C)和14(C₂-P) Hz。基于化学位移和耦合方式，中间体4被推断为含有双键的结构。此外，使用N-¹³C-1作为底物时，其核磁实验进一步证实了该活性中间体的结构及反应路径。

图3. DfmD 催化反应的stopped-flow吸收光谱(左)，不同时间点淬灭样品的LC-MS(右)

为了进一步识别DfmD反应中的催化活性物种，作者采用stopped-flow absorbance（SF-Abs）吸收光谱进行动力学研究（图3）。作者发现当使用1,2-²H₄-1时，可以观察到吸收光谱振幅增加同时伴随着该物种的慢慢衰减，这也表明很可能在攫氢步中存在同位素效应。作者还通过化学淬灭实验证明了在SF-Abs中观察到的长寿命活性物种的作用，综合动力学分析以及化学淬灭实验，这种长寿命物种在中间体4生成之前积累，它的衰减与4的形成有关。

图4. Zero-field Mössbauer光谱监测活性物种积累

与此同时作者还考察了底物中甲基对该反应的影响。在SF-Abs和FQ-Mössbauer实验中发现（图3和图4)，化合物8触发了新的铁催化物种的形成，快速混合DfmD•Fe(II)•2OG•8络合物与O₂导致在SF-Abs中出现高度相似的光学特征。虽然形成速率常数明显要小得多，衰减动力学不受影响（图3）。此外，DfmD•Fe(II)•2OG•8络合物呈宽四极双峰，与使用1作底物观察到的铁物种相比，四极分裂的幅度从0.65变为0.75毫米/秒。在75秒时，这个中间体衰减到<10%（图4）。从FQ-Mössbauer实验中可以发现，用质子取代甲基可能会影响底物与酶的结合，进而影响铁物种的电子结构和反应结果。因此，作者认为底物中的季铵阳离子对该反应效率和方向至关重要。

图5. (a) DfmD催化的反应涉及两步过程；(b) 可能的反应机制

综上，这些结果充分证实了DfmD催化的反应包括两步。如图5所示，在第一步反应中，Fe(IV)-oxo物种攫氢生成烯烃中间体4。第二步，在氮甲基上攫氢后，原位形成氮杂环丙烷中间体，随后C₃-N键断裂，羟基化得到中间体2，接下来2离去一分子甲醛后得到最终产物3。目前的研究为非血红素铁依赖酶催化的碳碳键形成反应提供了新的机理见解，有关DfmD反应的详细机制仍在在进一步调查中。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，文章的第一作者是北卡州立大学博士后李晓军博士，通讯作者为Wei-chen Chang教授和卡内基梅隆大学Yisong Guo教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Mechanism of Methyldehydrofosmidomycin Maturation: Use Olefination to Enable Chain Elongation

Xiaojun Li, Shan Xue, Yisong Guo,* and Wei-chen Chang*

J. Am. Chem. Soc. 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c01924

导师介绍

Wei-chen Chang教授，北卡罗莱纳州立大学，课题组运用化学合成，生物化学反应测试、分子生物学等研究手段致力于（1）深入解析酶促反应化学机理，（2）开发有机分子化学酶法合成新路线以及非天然新反应。经由基础研究为开发潜在候选药物分子奠定基础。课题组自成立以来研究成果发表在JACS，Angew Chem Int Ed，PNAS，ACS Catalysis等高水平期刊杂志，详情请见课题组网站：https://changlab.wordpress.ncsu.edu/  。