现场即时检测（point-of-care testing，POCT）是在采样现场进行的、利用便携式设备及配套试剂快速得到检测结果的新方法，具有便携、成本低、上样量少等优点，对于传染病和人类疾病的快速诊断尤为重要。近年来，利用现有便携式设备来检测核酸、蛋白及小分子等得到了科研人员的广泛关注。例如，将功能核酸作为识别元件，利用血糖仪检测DNA、温度计检测可卡因、验孕试纸条检测病毒基因等。然而，实现这些检测的共同之处在于：1）需要使用特殊底物来产生信号；或2）需要借助磁球等材料来分离反应产物。因此，这些方法不利于实现终端的便携式诊断。

近日，中国科学院长春应用化学研究所杜衍研究员与麦克马斯特大学李应福教授团队利用1）简便、快速、扩增功能强大的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术、2）特异性高的立足点介导核酸链置换技术（toehold mediated strand displacement）、3）利用滚环扩增反应（rolling circle amplification，RCA）制备的微米级DNA纳米花（DNA NF）结构、以及4）1 ：1单价态偶联的蛋白质核酸（hCG-DNA）标记技术，合作构建了基于商品化验孕试纸（PTS）的免分离、一步核酸检测新技术。作者将治疗乙肝病毒（HBV）的药物拉米夫定（LAM）和恩替卡韦（ETV）相关的单碱基突变位点rtL180M作为靶基因，设计了特异性的hCG-DNA三通探针（L180M-3wj）并固定于DNA NF基底上。由于DNA NF在侧向层析试纸上不流动的特性，使其不能在PTS上流动产生信号；当正确基因的扩增产物存在时，L180M-3wj探针中，标记着hCG的P1链被释放出来，从而在PTS上产生阳性信号。

本方法具有以下优点：1）灵敏度高，可检测低至2拷贝/微升的基因；2）特异性好，能够高度区分HBV的野生型基因（rtWT）与rtL180M耐药突变型基因；3）可实现临床样本的检测，其结果与荧光法、直接测序法的检测结果一致，证明该方法的可靠性；4）通过对L180M-3wj-DNA NF探针在冻干后室温存储的稳定性和溶液状态下4 ℃存储的稳定性考察，表明探针的活性在一个月后仍分别保持原来的82.3%和87.6%的活性。这是首次将PTS、LAMP、链置换技术与DNA NF结合起来，所构建的简便、免分离的“信号开”型核酸检测新方法，得益于DNA NF与L180M-3wj的高效杂交与LAMP扩增产物对hCG-P1的有效置换。鉴于其广普性，该平台可用于检测各种病原体和人类疾病相关的遗传变异。

论文信息：

A DNA Nanoflower Assisted Separation-free Nucleic Acid Detection Platform with Commercial Pregnancy Test Strip

Lijuan Qi, Meiting Yang, Dingran Chang, Wenjing Zhao, Sicai Zhang, Yan Du, Yingfu Li

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202108827

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