四川大学李峰课题组JACS：DNA分子天平实现核酸化学修饰的原位测量

随着DNA纳米技术领域的蓬勃发展，DNA已不仅仅是遗传物质的化学基础，更可以被当作一种可预测、可编程的生物高分子材料。为了进一步拓展DNA的功能性，化学修饰的核酸分子被越来越多地应用于材料、生物、医疗等多个领域。化学修饰极大地扩展了DNA的功能同时也带来了理论上的难题，即现有的核酸计算模型及软件（NUPACK、oxDNA、VisualDSD、caDNAno等）无法预测核酸分子中的化学修饰可能带来的热力学和动力学改变。熔解曲线分析，差示扫描量热分析以及等温滴定量热分析等传统实验测量技术普遍存在无法测量动力学参数且仪器昂贵、操作复杂、耗时长以及准确度低等技术瓶颈，并且无法可靠地测量如偶氮苯等热不稳定化学修饰的核酸分子。

为了克服上述技术挑战，四川大学李峰教授（点击查看介绍）课题组利用动态DNA纳米技术，创造性的开发了DNA分子天平（DNA Balance）技术，实现了热不稳定核酸化学修饰环偶氮苯的动、热力学参数的精准原位测量。

本文中，DNA分子天平由两条分别标记了荧光基团和猝灭基团的DNA链互补而成，DNA砝码由一系列已知动、热力性质的DNA单链组成。如同使用经典的天平，DNA分子天平通过将化学修饰核酸分子与已知动、热力学参数的砝码DNA分子一一比对，并利用自主开发的数学模型直接测量出其动、热力学参数（图1a,b）。为了证明方法的可行性和优势，作者选取了环偶氮苯（cyclic-Azobenzene，cAB）作为测试平台。cAB是光开关 DNA 修饰的代表性类别，光照和环境温度会影响构象转化（cis-cAB和trans-cAB），使用传统技术难以直接探测cAB修饰核酸的热、动力（图1c）。

图1. (a) DNA天平示意图。(b) DNA天平工作原理。(c.d) 环偶氮苯的结构和光异构化。(e) cAB 修饰对 DNA 双链体稳定性的影响。

作者首先基于DNA天平对cis-cAB修饰的热力学进行了表征。DNA天平和一系列DNA砝码反应，可以获得对应的热力学曲线（yield~ΔG），因此通过对比引入cis-cAB修饰前后热力学曲线的偏移（ΔΔG）便可以获得化学修饰带来的热力学变化（ΔΔGcis°）（图2 a,b）。作者测试了在DNA链的不同位置上修饰单个cis-cAB，以及在同一位置修饰不同数量cis-cAB（图2 c-g）。结果显示，所有 cis-cAB 修饰都获得了正的ΔΔGcis°，说明cis-cAB会降低DNA双链稳定性，这一结论与文献报道一致，证明了方法的可靠性。同时DNA天平测量结果与DNA标准熔解曲线实验结果接近，进一步证明了方法的准确性。

图2. DNA天平表征 cis-cAB修饰DNA的热力学。

然后，作者基于DNA分子天平和数学建模对cis-cAB及trans-cAB修饰的动力学进行分析。对于动力学分析，含有cis-cAB修饰 DNA 的链置换反应速率常数可以通过监测实时荧光信号直接测量。然而，对于涉及trans-cAB的链置换反应，直接测量是不可能的，因为不稳定的trans-cAB会自发地转化为cis-cAB，从而导致更复杂的动力学行为；但可以通过比较存在和不存在瞬态异构转化的链置换反应动力学得出trans-cAB修饰的链置换反应速率。

作者把cis-cAB修饰的DNA天平在有或无390 nm光照射后分别与两组含有相同系列的DNA砝码反应，通过比较链置换反应动力学曲线，可以筛选出对trans-cAB比较敏感的DNA砝码。理论上trans-cAB能通过更有利的平面构象稳定双链。从筛选的实验结果来看，和理论预期一致：trans-cAB 稳定了 DNA 双链体，从而显着减慢了链置换的速度。

图3. DNA天平表征cAB修饰DNA的动力学。

筛选出对cAB异构化动力学敏感的DNA砝码后，就可以进一步分析trans-cAB修饰的动力学参数。但由于涉及trans-cAB的反应过程复杂，因此作者采用数学建模和实验验证两者结合的方式测量反应动力学参数。作者首先针对cAB异构化动力学最敏感的DNA砝码建立数学模型，并用计算机模拟出动力学曲线，随后通过实验获得了和模拟结果高度吻合的曲线，证实了模型的可靠性，最后得出了异构化过程的速率常数（k₁）、cis-cAB修饰的链置换反应速率常数（k_3app）、trans-cAB修饰的链置换反应速率常数（k_2app）。作者还改变了cAB修饰的数量，并选取相应对瞬态异构转化动力学敏感的DNA砝码进行分析。结果显示，当增加 cAB 修饰的数量时，异构转化速率略有增加，cis-cAB和trans-cAB修饰对应的链置换反应常数保持了相同的量级。

图4. 通过实验测量和计算机模拟，获得DNA 天平反应涉及的速率常数。

获得的cAB修饰动力学参数可以进一步粗略评估DNA天平测量瞬态动力学反应速率界限。通过实验获得有和没有瞬态反应的链置换反应速率常数后，通过数学模型获得图5所示的结果，表明本文的方法可以准确测量（小于5%的偏差内）速率常数在1.08×10^-11和7.50×10^-14 M•s^-1之间的瞬态异构化反应。宽（超过2个数量级）的动力学窗口适用于测量DNA中多种类型的瞬态反应。

图5. 模拟评估DNA天平探测瞬态动力学范围。

最后，作者基于DNA分子天平和计算机模拟获得的动力学参数，进一步对trans-cAB修饰DNA的热力学进行分析，获得了cis-cAB和trans-cAB转变的标准吉布斯自由能以及trans-cAB修饰带来的热力学参数变化值。

与传统方法相比，本文开发的DNA分子天平具备操作简便、仪器要求低、原位测量、通量高等技术优势，可以同时测定动、热力学参数，并能推算出DNA上瞬态化学变化的动、热学参数，因而有望被广泛应用于各类天然及合成DNA化学修饰的精准测量，对DNA纳米技术、材料技术、生物医疗技术等多方面起到积极地推动作用。

本文第一作者是布鲁克大学-四川大学联合培养博士研究生王冠，通讯作者是四川大学李峰教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

DNA Balance for Native Characterization of Chemically Modified DNA

Guan Alex Wang, Junpeng Xu, Sarah M. Traynor, Haodi Chen, Fatma Eljabu, Xinghong Wu, Hongbin Yan, and Feng Li 

J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 13655-13663, DOI: 10.1021/jacs.1c05236

导师介绍

李峰，四川大学化学学院教授，博士生导师，加拿大布鲁克大学（Brock University）化学系、生物技术中心兼职教授，主要从事DNA纳米技术的相关基础研究及拓展其在分析化学及临床诊断中的应用，在Chemical Reviews、Chemical Society Reviews、Nature Communications、JACS、Angewandte Chemie、ACS Nano、Chemical Sciences、Analytical Chemistry等国际顶级期刊发表论文60余篇，长期担任Nature Biomedical Engineering、Nature Nanotechnology、Nature Communications、JACS、Angewandte Chemie等学术期刊的特约审稿人。获得国家高层次人才计划（青年项目），加拿大化学会Fred Beamish Award、Ontario Early Researcher、四川省特聘专家等多项国内外奖励。课题组长期提供博士后、博硕士研究生、科研助理等职位，欢迎有意向的同学与课题组联系。

李峰教授课题组主页

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