Angew. Chem. Int. Ed. | 红色及远红锌离子探针实现胰岛素分泌的多通道成像

2021年8月23日，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心陈知行研究员课题组在Angew. Chem. Int. Ed.杂志上在线发表题为“Red- and Far-Red-Emitting Zinc Probes with Minimal Phototoxicity for Multiplexed Recording of Orchestrated Insulin Secretion”的文章。分子医学研究所2019级博士生张钧维、博士后彭晓红、研究助理吴云翔（现UW Madison 博士研究生）、定量生物学中心博士后任会霞为本文的共同第一作者。未来技术学院陈良怡教授和定量生物学中心汤超教授为该研究提供了合作指导。

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锌离子(Zn2+)的化学生物学对人类健康至关重要，其浓度分布在不同细胞器或组织内显示出很高的异质性 (nM 至 mM数量级)。过去20年间，荧光成像技术由于其指示的直观性逐渐成为研究锌离子化学生物学不可或缺的利器，而锌离子荧光探针作为该技术和核心工具也得到了长足的发展。

胰岛素在胰岛β细胞中与锌离子共结晶形成致密核心并在高浓度葡萄糖刺激下共同释放至细胞外参与血糖调控，所以特异性标记胰岛素/Zn2+晶体结构可以指示胰岛素囊泡分泌事件。北京大学分子医学研究所彭晓红博士在陈良怡教授的指导下，研发了一套新的胰岛成像技术来探究胰岛素的分泌机制：利用锌离子荧光探针特异性标记Zn2+/胰岛素的晶体结构，采用高速转盘共聚焦显微镜(spinning-disc confocal microscopy)成像，可在无损胰岛上观察每个β细胞的胰岛素囊泡分泌事件。但市面上的锌离子荧光探针仍存在亲和力普遍过高、发射波长较短而无法与其他颜色荧光探针联用、生物相容性差、光毒性较高等问题，限制了其在该技术中的应用。

2018年，陈知行研究员加入了北京大学，建立了分子探针技术实验室。和陈良怡教授课题组等多个合作团队在生物成像方向形成了交叉学科群，共同推动国家成像中心的建设和未来成像技术的发展。陈知行研究员团队张钧维和吴云翔开展了锌离子探针的合作研究。传统以四甲基罗丹明为母体的不透膜锌离子染料（RhodZin-1）由于其荧光母核较强的亲脂性而进入细胞产生非特异性染色，并在长时程荧光成像过程中产生光毒性导致细胞凋亡。团队将罗丹明母核中位于N原子上的甲基替换为吗啉环以增强荧光母核的亲水性，使其长时间停留在细胞外进而避免非特异性染色以及光毒性，从而实现了对于胰岛素囊泡分泌事件的长时间监测。

通过改变荧光探针螯合基团的化学结构，团队构建了5种具有不同亲和力（Kd为 190 nM 至 74 μM）的红色锌离子荧光探针PKZnR 1-5，并成功在来自鼠源和人源的细胞和组织层次上实现了胰岛素囊泡分泌事件的长时程监测。该系列探针还可以对胰岛素的异常分泌动态进行实时响应，预示了其在高通量筛选治疗胰岛素分泌异常疾病药物中的潜在应用。

远红发射的荧光探针可以与其他通道的荧光探针联用以揭示生物体内不同活性物种间的相互作用，但其化学合成往往面临较大挑战。团队应用全新的化学合成策略(late-stageN-alkylation)，实现了以硅罗丹明为母体的远红锌离子探针PKZnFR 1-3的温和、高效合成。其中化学稳定性最优的PKZnFR-3通过与蓝色细胞核染料Hoechst，绿色可遗传编码钙离子探针GCaMP6f，红色低光毒性线粒体探针PK Mito Red联用，实现了四色、3D、长时程荧光成像，并通过数据分析初步探索了钙离子内流、线粒体信号以及胰岛素囊泡分泌事件的异质性及三者之间的复杂关系。

综上，北大跨学科团队报道了一系列低亲和力、不透膜的红色和远红发射的锌离子探针，为胰岛素囊泡分泌事件的成像新技术量身定制。该系列染料还可以与其他颜色探针联用进行多色、多维、长时程成像以揭示不同通路间的复杂关系，有望推动胰岛素分泌相关的内分泌研究跨入系统生物学时代。

该研究得到北京市科委、国家自然科学基金、和北大-清华生命科学联合中心的资助。值得一提的是，陈知行团队在建立之初，得到了王初课题组在化学实验室空间方面的大力帮助。在此特别感谢王初课题组的支持！

陈知行课题组一直致力于通过化学原理设计新型分子，推动生物成像技术的发展。团队常年招收博士后与硕士起点博士研究生，欢迎合成化学与化学生物学背景的同事关注与合作！

本文作者：ZJW

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202109510 

原文引用：Angew. Chem. Int. Ed. 10.1002/anie.202109510