基于巯基葡萄糖/葡萄糖氧化酶的硫化氢/过氧化氢双释放系统及其在蛋白特异性过硫化修饰中的应用

活性硫和活性氧对于生物体内氧化还原平衡的调节具有重要的作用。硫化氢作为研究最为广泛的活性硫，其水平的异常往往伴随如癌症、炎症以及高血压等病理过程。作为活性氧的核心物种，过氧化氢的过量产生会引起氧化损伤，导致衰老和神经退行性疾病。内源性硫化氢和过氧化氢分别具有各自的信号通路，而在某些特定的氧化还原信号传导中，硫化氢和过氧化氢却表现出相互协同作用。例如，在蛋白质过硫化这一硫化氢参与的重要翻译后修饰中，蛋白巯基首先被过氧化氢氧化得到次磺酸，随后与硫化氢反应，最终实现过硫化。因此，研究硫化氢和过氧化氢真实的生物活性往往需要二者同时存在。

目前，活性硫和活性氧供体分子的开发受到研究者们的广泛关注。然而现有的各种供体依然存在不足，如：1) 合成型供体在释放过程中会不可避免地产生大量有机副产物，引起某些未知副反应；2) 酶响应供体，特别是过氧化氢供体极为有限；3) 仅可释放单一物种，难以模拟硫化氢和双氧水的共存状态，因此无法用来研究二者的协同效应。

近日，美国布朗大学鲜明教授课题组利用巯基葡萄糖和葡萄糖氧化酶发展出一类酶促可控释放硫化氢/过氧化氢的双供体系统。葡萄糖氧化酶可催化氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，因而被广泛用于构筑生物传感器及多模态肿瘤诊疗系统。当以1-巯基-β-葡萄糖作为底物时，氧化后得到的硫代葡萄糖内酯经水解会释放出硫化氢，同时氧气被还原为过氧化氢，从而完成硫化氢/过氧化氢的双释放（图1）。并且，这一过程仅产生无毒且生物相容性良好的葡萄糖酸，因此具有良好的生物应用潜力。

图1. 课题设计

首先，作者通过经典的亚甲基蓝法测定了巯基葡萄糖的硫化氢释放能力。作者发现，巯基葡萄糖在中性缓冲液中较为稳定。而加入葡萄糖氧化酶后，可随时间变化，持续缓慢释放硫化氢（图2）。

图2. 硫化氢释放能力测定

随后，作者利用FOX 1试剂对体系中生成的过氧化氢进行了测定。结果显示，该体系可随时间变化缓慢释放出过氧化氢，而同时加入过氧化氢酶可将其彻底清除且不影响硫化氢的释放（图3）。所以，巯基葡萄糖在葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的共同存在下还可作为单独的硫化氢供体使用。

图3. 过氧化氢释放能力测定

接下来，作者尝试将巯基葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系用于诱导蛋白质过硫化。将牛血清白蛋白与糖/酶体系室温共孵育一小时，随后加入过硫化物特异性探针SSP-4，可观察到高于单一组分对照8~30倍以上的荧光强度。作者发现，糖/酶体系的反应效果明显优于加入相同浓度的硫化氢和过氧化氢。作者随后通过液相色谱-串联质谱对牛血清白蛋白的过硫化物进行了检测。高能碰撞解离串联质谱结果表明，过硫化修饰发生在半胱氨酸-34。另外，这一糖/酶体系可同样用于诱导木瓜白蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的过硫化反应。

最后，作者对巯基葡萄糖/葡萄糖氧化酶这一平台的可调控性进行了初步探索。作者认为，巯基葡萄糖可以视作硫化氢/过氧化氢的载体，通过进一步修饰触发基团，可实现特异性生物刺激源响应的硫化氢/过氧化氢释放。为验证这一策略，作者制备了1-β-D-巯基乳糖和巯基葡萄糖二硫化物。结果表明，两类分子在中性缓冲液中均十分稳定。巯基乳糖和巯基葡萄糖二硫化物只有在除葡萄糖氧化酶外，分别辅以β-半乳糖甘酶和生物硫醇时才会释放出硫化氢和过氧化氢(图4)。这一结果说明，巯基葡萄糖/葡萄糖氧化酶这一组合可用于构筑具有多种刺激响应功能的前药体系。

图4. 可调控性探索

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，文章第一作者为布朗大学的博士后倪翔，通讯作者为布朗大学化学系鲜明教授。

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A Sweet H₂S/H₂O₂ Dual Release System and Specific Protein S-Persulfidation Mediated by Thioglucose/Glucose Oxidase

Xiang Ni, Xiaolu Li, Tun-Li Shen, Wei-Jun Qian, and Ming Xian*

J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 13325–13332, DOI: 10.1021/jacs.1c06372