新型通用的高通量蛋白质组学样品处理平台

近年来随着蛋白质组学领域的高速发展，其新研究方法和平台广泛运用于生命科学研究的各个方向，并逐步发展成为攻克各个研究课题的关键工具，尤其在生物标志物及治疗靶点药物的研发有突破性帮助。基于质谱技术的蛋白质组学的高通量药物筛选是一种非常有前景的技术，因为蛋白质组技术可以提供更加全面的信息（蛋白质定性、定量以及翻译后修饰），提高药物发现的成功概率。目前大多数蛋白质组学技术的技术发展主要致力于提高方法的灵敏度，数据采集速度，定性定量的准确度。但是样品处理的高通量平台一直是困扰研究的一关键限速步骤。最近，一些课题组也开始将研究转向提高蛋白质组学的样品处理的速度上，不过与实现真正的高通量还是有一定的差距。

近日由美国国立健康研究院转化医学研究所（NCATS）的陶定银博士及其团队发展的一种高通量高自动化的蛋白质组学样品处理平台，实现了从384孔板细胞培养到直接运用于质谱分析的一体化蛋白质组学样品处理操作。该系统平台优化了基于Bravo的高度自动化液体转移机器过程和参数，可用于从100到10000个细胞里提取蛋白质、变性、还原、烷基化、蛋白质沉淀、酶切以及到最后纯的肽段用于质谱的分析。相关成果发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry 上，并被选为补充期刊封面文章予以推荐。

蛋白质组学的样品处理主要基于溶液方式（in-solution），从蛋白质提取开始加入变性剂以破坏四级结构提高其溶解性，然后加入还原剂打断蛋白质的二硫键，同时加入烷基化试剂将打开的二硫键保护起来避免重新形成二硫键，最后加入胰蛋白酶等酶用于将完整蛋白质切成分子量更小的肽段碎片，最终的肽段样品还需进行脱盐处理以免污染质谱降低灵敏度。本文作者创新性的使用“一锅法”预混蛋白质提取剂、混合变性剂和还原剂一次性完成多个样品处理步骤。该方法大大减少样品转移消耗和误差同时有效提高样品处理及提取效率。具体如图1所示：

图1. 高通量蛋白质组学样品处理平台示意图

首先将该平台用于HeLa 细胞，经过对HeLa细胞384孔培养板进行优化表征后，所得样品直接用于液相色质谱蛋白组学分析。同时设置对等量的商品化的HeLa酶切肽段为对比组。结果如图2所示，在相同液相色谱质谱分析方法下，新平台在细胞数500进样量时有显著优势，高通量蛋白质组学平台处理的样品鉴定到的肽段数目比传统商品化方法高出50%。这不仅仅是鉴定数量的提高，同时也为因珍贵样品量稀少所限的课题提供一种可靠的新方法和进一步深入研究的可能性。

图2. 高通量蛋白质组学样品处理平台表征和优化

随后进行的一系列在同一384孔板的重现性实验，不同384孔板重现性及不同操作者的重现性实验，结果显示该平台重现性高、误差小、结果稳定。为进一步提高酶切通量并考察方法的适应性，作者将商品化的快速酶切试剂盒方法（1-3小时酶切时间）改进，然后在平台上进行实验。所获得的蛋白质鉴定结果以及重现性略好于传统的过夜酶切方法（12-16小时）但大大缩短了酶切时间，每384孔样品盘可控制在4-5小时。样品处理时间的缩短大大降低了样品污染和外界干扰给实验结果带来的错误及误差。结果如图3所示：

图3. 高通量蛋白质组学样品处理平台的重现性以及适应性考察

最后作者对该处理平台进行通用性考察。作者选用六种不同器官及不同疾病细胞系进行处理和分析，所得蛋白鉴定数量和趋势与预期相符（图4A、4B），表明该平台具有优良的通用性，可适用于各种细胞系的生物学分析，为各领域的蛋白质组学分析提供可靠平台基础。作者进一步对六种不同细胞系的蛋白质鉴定结果进行生物信息学分析，主成分分析（PCA，图4C）显示六种不同细胞系完全分离。蛋白质的细胞通路及功能学heatmap分析（图4D）显示每种细胞系都有自己独特的细胞通路变化，这为后续生物学靶向研究提供了强有力的方向性指导和辅助。

图4. 平台应用于六种不同细胞系进行通用性考察

目前，因蛋白质组学的灵敏度及精确度的提高，在生命科学领域的应用越来越广泛。该文作者开发的这一新型高通量样品处理平台可以显著提高蛋白质组学技术在生物标志物的研发、临床样品的分析和靶向药物筛选中的应用。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Universal and High-Throughput Proteomics Sample Preparation Platform

Andrew P. Burns, Ya-Qin Zhang, Tuan Xu, Zhengxi Wei, Qin Yao, Yuhong Fang, Valeriu Cebotaru, Menghang Xia, Matthew D. Hall, Ruili Huang, Anton Simeonov, Christopher A. LeClair*, and Dingyin Tao*

Anal. Chem., 2021, 93, 8423–8431, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c00265

通讯作者简介

陶定银，博士，毕业于中科院大连化学物理研究所，现任美国国家健康研究院（NIH）转化医学中心质谱实验室负责人。长期从事基于质谱技术的高通量药物筛选方法研究和应用，多组学技术方法发展及生物标志物的发现和诊断试剂盒的开发，取得了一系列创新性成果。在Science Translational Medicine、Nature Methods等期刊发表50多篇文章，多篇文章被选为封面。担任Frontiers in Genetics杂志客座主编以及近二十种期刊杂志审稿人。