基于特异性转录调控因子LhgR的L-2-羟基戊二酸生物传感器

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

L-2-羟基戊二酸（L-2-Hydroxyglutarate，L-2-HG）参与碳饥饿响应、肿瘤发生及缺氧适应等多个生理过程，但生物体感应并调控L-2-HG代谢的机制未见报道。另外，L-2-HG是L-2-HG尿症及多种癌症的标志性代谢物，在生物体正常生理代谢中也扮演重要角色，建立L-2-HG的高效、专一性检测方法具有重要的临床与研究意义。目前，L-2-HG的检测主要依赖于LC-MS/MS与GC-MS/MS等昂贵、繁琐的技术手段，难以实现手性异构体D-2-HG与L-2-HG的有效分离及活细胞内L-2-HG的动态检测。

针对以上难题，山东大学微生物技术国家重点实验室与上海交通大学、山东大学第二附属医院合作揭示了恶臭假单胞菌W619中L-2-HG分解代谢的调控机制，鉴定了可专一性感应L-2-HG的转录调控因子LhgR，并将其与荧光共振能量转移技术（FRET）相结合，构建了一种高性能的L-2-HG生物传感器，并应用于不同生物学样品、细菌及人类细胞中L-2-HG的检测。研究成果近日发表于Nature Communications，山东大学博士生康照琪为论文第一作者，山东大学高超教授与上海交通大学许平教授为该论文的共同通讯作者。

在本工作中，研究者基于比较基因组学分析发现，在恶臭假单胞菌W619中L-2-HG分解代谢关键酶LhgO上游编码GntR家族转录调控因子LhgR。生物学功能分析表明LhgR可结合至lhgO的启动子区域并抑制lhgO的转录，L-2-HG为LhgR的特异性效应物可抑制LhgR与lhgO启动子的结合。研究者将青色荧光蛋白mTFP与黄色荧光蛋白Venus分别融合至LhgR的N末端与C末端，开发了L-2-HG生物传感器LHGFR_0N0C（图1）。LHGFR_0N0C以剂量依赖方式响应于L-2-HG的添加，研究者进一步通过截短LhgR与荧光蛋白间linker对传感器进行优化。其中，传感器变体LHGFR_0N7C动态范围60.37 ± 1.30%，K_d值为7.22 ± 0.38 μM；传感器变体LHGFR_0N3C动态范围56.13 ± 0.29%，K_d值为29.33 ± 1.24 μM。两个传感器变体在检测特异性、动力学、温度稳定性、可逆性及pH稳定性等方面均表现出优异的性能。

图1. LHGFR的设计与表征

L-2-HG传感器可应用于人体血清、尿液及细菌培养基中L-2-HG检测，结果与当前L-2-HG标准检测方法LC-MS/MS具有非常高的一致性（图2）。研究者进一步将开发的生物传感器应用于细菌胞内L-2-HG检测，在大肠杆菌中表达的LHGFR_0N3C以剂量-依赖方式响应于外源L-2-HG添加，并可实时动态检测碳饥饿诱导的大肠杆菌胞内L-2-HG波动。此外，研究者还实现了L-2-HG传感器对人类细胞中L-2-HG的实时动态检测（图2），利用该生物传感器鉴定了L-2-HG脱氢酶在L-2-HG分解中的作用，确定缺氧可诱导L-2-HG的胞内积累。该工作提供了不同生物学样品、细菌及细胞中L-2-HG检测的灵敏简易方法，有助于L-2-HG代谢及相关疾病诊疗研究的开展。

图2. LHGFR在不同生物学样品、细菌及细胞内L-2-HG检测中的应用

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An L-2-hydroxyglutarate biosensor based on specific transcriptional regulator LhgR

Zhaoqi Kang, Manman Zhang, Kaiyu Gao, Wen Zhang, Wensi Meng, Yidong Liu, Dan Xiao, Shiting Guo, Cuiqing Ma, Chao Gao & Ping Xu 

Nat. Commun., 2021, 12, 3619, DOI: 10.1038/s41467-021-23723-7

高超教授简介

高超，山东大学微生物技术国家重点实验室教授。2009年于山东大学获得博士学位，2012年起就职于山东大学。研究方向为微生物生理与代谢、系统代谢工程与生物传感技术。研究成果发表于Nat. Commun.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、Cell Discov.、Green Chem.、Metab. Eng.、mBio、J. Biol. Chem.等期刊。曾获得长江学者奖励计划青年学者、山东省自然科学杰出青年基金、山东大学齐鲁青年学者等。

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：L-2-HG是L-2-HG尿症及多种癌症的标志性代谢物，开发高效、专一性的L-2-HG检测方法至关重要，但目前L-2-HG标准检测方法LC-MS/MS与GC-MS/MS成本高、操作繁琐且与活细胞中L-2-HG实时检测不兼容。基于FRET的荧光生物传感器可很好的解决上述问题，该类型生物传感器的构建依赖于可专一性感应待测物的信号识别元件的发现。微生物经漫长的演变已进化出可响应并分解不同代谢物的能力。论文作者所在的微生物技术国家重点实验室是国际领先的微生物研究基地与微生物技术创新平台，该研究目的是从微生物中挖掘L-2-HG特异性的信号识别元件，并在此基础上建立一种高效、专一性的L-2-HG检测方法。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：该研究中最大的挑战是筛选并鉴定L-2-HG特异性的转录调控因子。研究团队前期在2-HG的代谢机制与生理意义方面具有较好的研究积累（Nat. Commun., 2018; PNAS, 2017; mBio, 2019; J. Biol. Chem., 2018），确定了微生物中L-2-HG分解代谢关键酶LhgO。在此基础上，研究团队对已测序的4929株细菌进行了生物信息学分析，通过比较不同细菌中LhgO编码基因上下游区域，幸运的在恶臭假单胞菌W619中LhgO上游鉴定到一个可专一性感应L-2-HG的转录调控因子，并应用于后续FRET生物传感器的构建。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该研究开发的L-2-HG生物传感器具备良好的特异性与灵敏性，对人体血清与尿液中L-2-HG的最低检测限分别为1.68 μM和0.92 μM，具体检测过程方便快捷，可应用于L-2-HG尿症、L-2-HG相关癌症的临床诊断与治疗结果评估。另外，L-2-HG在细胞的正常生理活动中扮演着重要的角色。比如，近期研究表明L-2-HG可促进CD8⁺ T淋巴细胞的增殖与抗肿瘤能力、帮助细胞减轻还原压力及通过表观遗传修饰协调糖酵解通量等。该研究构建的L-2-HG生物传感器可对细菌、人类细胞内L-2-HG进行原位、实时动态的检测和成像，可为研究者更好地理解L-2-HG代谢网络、高通量筛选L-2-HG代谢相关基因与相关癌症治疗药物提供技术支撑。