滚环扩增-CRISPR/Cas12a介导的通用型免固载电化学生物传感器

开发具有高灵敏和特异性的检测平台用于临床相关生物分子的检测，对于疾病的监测和确诊具有非常重要的意义。在过去的几年中，CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 技术不仅掀起了基因编辑的热潮，也引发了分子诊断技术的革新。借助Cas12a酶的单链DNA反式剪切（trans-cleavage）活性，并结合各种等温核酸扩增技术，已开发了一系列基于荧光信号输出的CRISPR/Cas分子诊断平台。然而，由于缺乏通用的靶标传导策略，目前大多数CRISPR/Cas分子诊断策略仅适用于单一靶标分析，且只能分析核酸类靶标，限制了其在临床诊断中的应用。考虑到这些基于光学转导的传感器需要在昂贵且复杂的设备上完成，有必要将CRISPR/Cas系统扩展到免固载型电化学生物传感领域。

近日，西南大学李念兵教授（点击查看介绍）和罗红群教授（点击查看介绍）团队构建了一种基于滚环扩增（RCA）-CRISPR/Cas12a介导的免固载型电化学生物传感器，实现灵敏地、特异性地检测与疾病相关的核酸和小分子。该传感器无需将识别探针固定到电极表面，大大简化了电极制备步骤，且表现出信号增强型输出模式。如图1所示，阻断探针（BP）作为Cas12a酶的反式剪切底物，亚甲蓝标记的报告探针（RP）能与BP探针互补杂交。在没有靶标的情况下，即未激活的Cas12a酶无法剪切BP探针，BP探针将与RP探针杂交形成双链DNA，该双链DNA无法被还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极（rGO/GCE）捕获，因此产生微弱的电化学信号。相反，一旦crRNA引导Cas12a酶与通过RCA反应生成的TS链组装形成Cas12a-crRNA-TS-NTS复合物，Cas12a酶将不加选择地剪切BP探针。因此，亚甲蓝标记的RP探针可以通过π-π堆积作用紧密地吸附在rGO/GCE表面，导致明显增加的电化学信号，从而实现对靶标的灵敏检测。只需要简单地调整RCA组件中靶标识别的序列，该策略即可灵活地应用于microRNA、病毒B19 DNA和5'-三磷酸腺苷的高灵敏和特异性检测，检出限分别为0.83 aM、0.52 aM和0.46 pM。此外，还可构建DNA输入的DNA逻辑电路（YES、NOT、OR、AND），图2所示，实现RCA-CRISPR/Cas12a系统对刺激响应的模块化和可编程设计，表明RCA-CRISPR/Cas12a系统具有执行复杂任务的潜力。

图1. RCA-CRISPR/Cas12a介导的免固载型电化学生物传感平台检测miRNA-21的工作原理：(A) miRNA-21存在时和(B) miRNA-21不存在时。

图2. 基于RCA-CRISPR/Cas12a系统的逻辑电路：(A) YES, (B) NOT, (C) OR, (D) AND。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是西南大学博士研究生卿敏。

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Universal and Programmable Rolling Circle Amplification-CRISPR/Cas12a-Mediated Immobilization-Free Electrochemical Biosensor

Min Qing, Sheng Liang Chen, Zhe Sun, Yi Fan, Hong Qun Luo*, and Nian Bing Li*

Anal. Chem., 2021, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c00805

导师介绍

李念兵

https://www.x-mol.com/university/faculty/13969 

罗红群

https://www.x-mol.com/university/faculty/13970