Anal. Chem.：单胺氧化酶B的快速双光子荧光成像用于诊断小鼠早期肝纤维化

纤维化是肝脏对损伤的一种典型反应。它会使肝细胞受损，导致肝脏功能紊乱，最终发展为肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭等肝脏性疾病，甚至引发死亡。早期肝纤维化无任何临床症状，发现时往往已发展到肝硬化，且治疗过程复杂、昂贵，严重者甚至涉及肝移植。迄今为止，尚无有效的抗纤维化治疗方案。多项临床研究表明，早期肝纤维化的优化治疗方式可以有效防止其进一步的发展及恶化，使肝纤维化完全逆转。因此，早期诊断肝脏纤维化对其及时进行干预治疗，逆转纤维化过程，阻断肝硬化的形成，保护肝脏功能具有重要意义。单胺氧化酶B（MAO-B）是一种黄素酶依赖型酶，可以将氨类的底物催化氧化成相应的亚胺，随后水解成为醛类化合物，其主要催化底物是苄胺和苯乙胺。有研究表明MAO-B不仅与神经性疾病密切相关，也参与胶原纤维的形成，其活性在早期肝脏纤维化病人血清中较正常人显著升高，所以被认为是一个肝脏纤维化理想的生物标志物。因此，开发合适的手段对MAO-B进行活体内的原位监测，将有助于肝脏纤维化的早期诊断，也能为深入了解MAO-B在肝脏纤维化过程中的重要作用提供研究工具。

近日，山东师范大学唐波教授（点击查看介绍）和李平教授（点击查看介绍）团队开发了一种快速识别MAO-B的双光子荧光探针BiPhAA（图1）。BiPhAA结构简单，容易制备，是在苯胺的邻位通过Suzuki偶联反应引入MAO-B的特异性底物苯乙氨而构建。其中苯乙氨部分被MAO-B催化氧化后，生成醛基，继而与相邻苯环上的氨基反应生成碳氮双键而环化，导致整个分子的共轭体系增大，从而发射强荧光。体外研究表明BA可以高选择性、高灵敏度、快速地响应MAO-B的变化。正如预期的那样，BA在小鼠体内也能够实时原位成像MAO-B活性，并成功将肝脏纤维化小鼠与正常小鼠区别出来。相关成果发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry 上。

图1. (a) BiPhAA结构及反应机理；(b) BiPhAA用于追踪肝纤维化小鼠体的MAO-B。

首先，研究人员通过测试BiPhAA的光物理性能，确定了它能够快速识别MAO-B，且该反应具有高选择性、高灵敏度及高生物兼容性等优点。进而，将BiPhAA应用于活细胞中成像检测内源性MAO-B。如图2所示，经BiPhAA孵育的细胞发出明亮的荧光。而用MAO-B特异性抑制药物D-青霉胺（D-pen）处理后，绿色通道的荧光强度明显降低，表明BiPhAA可被细胞内MAO-B激活。经MAO-B Enzyme Specific Activity Microplate Assay Kit检测，发现D-pen处理的细胞提取液中MAO-B活性低于对照组，这与细胞中荧光的变化一致，进一步证明以上结论。

图2. 快速成像检测细胞中MAO-B。

随后，研究者考察了BiPhAA是否可以监测细胞内MAO-B的动态变化（图3）。由于肝星状细胞（LX-2）中MAO-B活性受到抑制，D-pen组细胞中荧光低于对照组。而细胞通过无氧条件培养激活，作者发现荧光信号显著提高。再次经D-pen处理后，荧光减弱。以上成像结果表明BiPhAA可以实时监测细胞中MAO-B活性变化。

图3. 可视化细胞中MAO-B的动态变化。

最后，BiPhAA被用于肝脏纤维化小鼠体中原位示踪MAO-B，通过其荧光变化诊断早期肝纤维化小鼠。首先，研究人员通过腹腔注射四氯化碳的橄榄油溶液建立小鼠肝纤维化模型。随后，作者使用双光子显微镜，尾椎静脉注射BiPhAA之后立即对小鼠肝脏组织进行了实时荧光成像。如图4所示，肝脏纤维化的小鼠体内显示出极强的荧光信号，这个信号是正常小鼠的六倍，暗示肝脏纤维化的小鼠体内MAO-B过表达。实验结果表明BiPhAA可以实时、原位成像活体内MAO-B，并且可以区分正常小鼠和纤维化小鼠体内的MAO-B水平。因而，作者提出的通过可视化MAO-B的活性而实现早期诊断肝纤维化的方法是可行的。

图4. 原位成像正常及肝纤维化小鼠体内的MAO-B。

总结

该工作设计了一种新型双光子荧光探针BiPhAA，该探针具有合成简单、光稳定性好、背景荧光低、选择性高等优点。更重要的是，探针可以快速、准确地对MAO-B进行检测。所以，BiPhAA非常适用于活体内MAO-B的实时原位成像。使用探针，在活体水平上对MAO-B进行实时原位成像，结果发现MAO-B水平在肝纤维化小鼠体内明显上调，并且可以将肝纤维化小鼠从正常小鼠中识别出来。该工作为早期肝纤维化的诊断提供了一种高灵敏度的荧光成像材料，并有望实现商品化。同时，BiPhAA也有望为肝脏纤维化的分子机制研究提供理想的工具。（作者：范楠楠；核稿者：苏迪）

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Rapid Two-Photon Fluorescence Imaging of Monoamine Oxidase B for Diagnosis of Early-Stage Liver Fibrosis in Mice

Nannan Fan, Chuanchen Wu, Yongqing Zhou, Xin Wang, Ping Li*, Zhenzhen Liu, and Bo Tang*

Anal. Chem., 2021, 93, 7110–7117, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c00815

导师介绍

唐波

https://www.x-mol.com/university/faculty/12175 

李平

https://www.x-mol.com/groups/liping