单细胞分泌蛋白分析揭示肿瘤微环境对巨噬细胞免疫响应的重要影响

分泌蛋白是由细胞分泌的可溶性功能蛋白分子，是细胞间通讯的重要“联络员”。单细胞水平的分泌蛋白分析可清晰展现每个细胞的功能，状态、细胞个体之间的差异及联系等群体细胞研究方法无法分辨的信息，是深入认识免疫细胞功能、肿瘤免疫治疗评估等方面的重要技术手段。目前单细胞分泌蛋白分析技术多种多样，主要包括流式细胞仪检测（多色荧光流式、质谱流式等）、酶联免疫斑点法以及基于微流控芯片技术的微雕术和单细胞抗体条形码技术等。但上述技术主要基于细胞在平面基底的培养、检测，即细胞是脱离了其自身微环境的分析，往往不能真实、准确反映细胞的状态、功能。而细胞微环境已被证明对细胞功能、命运具有重要影响，因此在单细胞分析平台上实现细胞微环境重建、集成，将有助于单细胞分析、检测获得更加精准的信息。但由于技术上的制约，单细胞分泌蛋白分析平台上的细胞微环境构建尚未得到解决。

近日，中国科学院大连化学物理研究所陆瑶团队在前期工作基础（Anal. Chem., 2018, 90, 5825-5832; Adv. Sci., 2019, 6, 1801361; PNAS, 2019, 116, 5979-5984）上，将细胞三维培养、肿瘤细胞共培养集成到单细胞分泌蛋白分析平台中，实现了模拟物理、生理微环境中的单细胞分泌蛋白分析。他们利用高密度PDMS（聚二甲基硅氧烷）微柱基底模拟细胞三维培养基底的物理微环境，利用肿瘤细胞共培养模拟细胞通讯、基质等生理微环境；将PDMS穿孔膜将上述微环境要素与包被了捕获抗体的玻片结合，构建模拟肿瘤细胞微环境的单细胞分泌分析平台。该芯片平台中的单细胞培养、分析单元中，可以按照肿瘤细胞与巨噬细胞的比例（从0：1到5：1）将单细胞分析数据分为6组，为单细胞分泌分析提供了不同细胞微环境下的结果对比。他们利用该平台研究了处于口腔鳞状细胞肿瘤微环境中单个巨噬细胞的免疫应答，包括TNF-a（肿瘤坏死因子a）和IL-6（白介素6）蛋白。巨噬细胞是人体免疫系统的第一道防线，具有识别、吞噬、清除细菌及外来异物的重要功能。巨噬细胞也具有很强的可塑性，如肿瘤微环境中巨噬细胞被证明从抗肿瘤角色转变为促进肿瘤发展的帮凶。研究者们利用集成了细胞微环境的单细胞分泌分析平台研究了肿瘤微环境对巨噬细胞免疫响应的影响。利用细菌模式分子LPS（脂多糖）模拟感染，他们发现口腔鳞状细胞癌（OSCC）微环境分别抑制了分化的U937和THP-1巨噬细胞单细胞TNF-a分泌率，但却增加了IL-6的分泌率，且程度随着OSCC与巨噬细胞数目的比例（0:1-5:1）增大而增强。继而又研究了人原代单核细胞分化的巨噬细胞的免疫响应，在OSCC肿瘤三维微环境中，巨噬细胞TNF-a分泌率无明显变化，但IL-6的分泌率随肿瘤数目的增加而增大。对单细胞分泌平台上的巨噬细胞的表型染色表明，OSCC肿瘤微环境改变了U937巨噬细胞的表型，部分巨噬细胞也从抗肿瘤的M1型诱导为促肿瘤形成的M2型，这可能是导致巨噬细胞TNF-a和IL-6分泌变化的原因。

图1. 集成肿瘤微环境的免疫单细胞分泌蛋白分析平台构建。（A）细胞三维培养基底、肿瘤微环境构建及分泌蛋白检测示意图；（B）图片为SEM表征三维微柱阵列基底的高通量微孔芯片；（C）肿瘤细胞与巨噬细胞在三维培养基底上的共培养，Mφ为巨噬细胞。

相关文章近期发表于美国化学会Analytical Chemistry 杂志。Analytical Chemistry 官方twitter以“Scientists combine a microchip 3D cell culture platform with single-cell secretion analysis to investigate the effects of tumor microenvironments on macrophage immune response.”为题介绍了该工作。（文/图 李林梅）

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Single-Cell Secretion Analysis in the Engineered Tumor Microenvironment Reveals Differential Modulation of Macrophage Immune Responses

Linmei Li, Weiwei Shi, Meimei Liu, Xue Bai, Yanting Sun, Xue Zhu, Haoran Su, Yahui Ji, Fengjiao Zhu, Xianming Liu, Yong Luo, Tingjiao Liu, Bingcheng Lin, and Yao Lu*

Anal. Chem., 2021, 93, 4198–4207, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c04604