单细胞拉曼技术缩短病原菌感染的诊断时间

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

世卫组织专家估计，到2050年，由于抗生素耐药导致的死亡人数可能从目前估计的每年70万人增加到每年1000万人，世界生产总值的损失将达到100万亿美元。导致耐药菌出现和蔓延的一个主要原因是在治疗感染类疾病时存在滥用和过度使用抗生素的情况。目前病原菌感染在临床的检验流程如图1所示，往往需要3-7天才能从病人标本中分析出病原菌鉴定和抗生素药敏的结果。快速检测感染细菌的药敏特性对确保有效抗生素的使用和减少对广谱药物的需求起着关键作用。那么如何准确且快速的判断感染细菌的药敏特性呢？近日，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所的宋一之、复旦大学附属华山医院的王明贵和英国牛津大学的Wei Huang联合团队利用单细胞拉曼光谱-重水标记联用技术开发了一种适用于血液和尿液标本的快速药敏检测方法 (FRAST)，该方法将尿液和血液标本的药敏检测时间由3-4天分别缩短为3和21小时。

图1. 传统尿液和血液样本药敏与FRAST血液和尿液样本比较

单细胞拉曼光谱 (SCRS) 是在单细胞水平对原核和真核细胞进行拉曼光谱的检测，反映了细胞化学成分的“指纹”。当细胞被原子质量更重的稳定同位素（如¹³C、¹⁵N和²H）标记后，细胞中生物分子的键能发生变化从而导致细胞的拉曼光谱中部分特征峰向低波数方向偏移。研究者发现在重水（氘代水）中培养的细菌通过辅酶I和辅酶II的还原过程将水中的氘转移进生物质，使细菌拉曼图谱中的C-H峰（2800-3000 cm^-1）偏移，出现C-D峰（2000-2300 cm^-1），成为单细胞水平细菌代谢活性的生物标志物。基于这一原理，Raman-DIP (Raman-Deuterium Isotope Labelling) 技术被提出可用于识别耐药细菌，在抗生素的作用下，由于抗生素抑制了细菌的代谢活动，易感菌的拉曼光谱中不出现这一条带，而耐药菌的拉曼光谱则有明显的C-D峰 (Sci. Rep., 2017, 7, 16648)。Raman-DIP技术在单细胞水平上工作的，可以克服临床微生物试验对长时间培养的要求，使快速药敏成为可能。

中科院苏州医工所联合团队基于Raman-DIP原理，开发了Fast Raman-assisted Antibiotic Susceptibility Test (FRAST)方法，可分别在3小时内和21小时内给出尿样和血样的药敏结果。FRAST方法的具体流程如图2所示。对于尿液感染标本，首先进行离心收集细菌，然后在共聚焦显微拉曼系统下对细菌观察并进行拉曼指纹图谱的采集，这一过程可判断尿液中是否有菌及菌量，同时将采集到的图谱利用机器学习模型与革兰氏阴性菌和阳性菌的数据库进行比对，准确预测样品中细菌的革兰氏阴阳性并以此选择合适的药敏板。将尿液加入到药敏板并作用1 h后加入重水，待重水标记1 h后离心洗涤样品并采集拉曼信号，通过对抗生素作用下的C-D峰的强度的统计计算读取最小抑菌浓度（MIC）。对于血液标本，则是在血培养瓶内进行培养，血培养瓶报阳后用同样的方法采集拉曼光谱并计算MIC值。

图2. FRAST用于临床尿液样本和血液样本的药敏试验流程图

在该研究中，团队对包含质控菌株和临床原始标本在内的超过3000个样本采集了6万余张单细胞拉曼光谱，并与临床金标准（微量肉汤稀释法或临床自动药敏系统）进行了对比，结果显示FRAST方法对革兰氏染色结果的预测准确率为100%（图3），药敏结果与金标准总体一致率大于88%。与其他基于Raman-DIP的病原菌药敏研究相比，该研究国际首次证明单细胞拉曼与重水标记结合可用于分析真实的尿液或血液标本中病原菌的耐药性，而且基于拉曼的革兰氏染色预测方法的整合使得FRAST成为相对独立完整的测试方法，临床医生可以无需其他手段辅助，完成“从样本到报告”的快速诊断。与近年来发展较快的耐药分子诊断技术相比，FRAST药敏是基于抗生素对细菌作用的表型，因此该结果不会因未知的耐药机制或基因表达调控影响而产生对药敏的误判。

图3. FRAST方法可以准确预测病原菌的革兰氏染色分类结果

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是衣晓飞、宋一之和徐晓刚。该研究得到了科技部重点研发计划、中科院科研仪器设备研制项目以及上海氘峰医疗器械有限公司的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Development of a Fast Raman-Assisted Antibiotic Susceptibility Test (FRAST) for the Antibiotic Resistance Analysis of Clinical Urine and Blood Samples

Xiaofei Yi, Yizhi Song*, Xiaogang Xu, Di Peng, Jingkai Wang, Xingwang Qie, Kaicheng Lin, Miao Yu, Mingfeng Ge, Yun Wang, Dayi Zhang, Qiwen Yang, Minggui Wang*, and Wei E. Huang*

Anal. Chem., 2021, 93, 5098–5106, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c04709

宋一之博士简介

宋一之，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究员、应用光学国家重点实验室客座研究员、中科院“百人计划”候选人、上海市青年“东方学者”获得者、苏州市高新区领军人才。2001年进入清华大学环境工程系学习，先后获得工学学士、博士学位。2011-2018年期间先后在清华大学、英国谢菲尔德大学和英国牛津大学任博士后研究员。2020年加入中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，任研究员，博士生导师。

宋一之研究员长期以来主要从事病原微生物和单细胞分析等领域的研究，在微生物单细胞表型的拉曼光谱学、单细胞基因组扩增、临床耐药菌耐药特征和合成生物学工具开发等领域取得了一系列重要的原创性成果。在Analytical Chemistry, Nucleic Acids Research, Environmental Science & Technology, Current Opinion in Chemical Biology和Microbial Biotechnology等期刊发表代表性论文二十余篇。申请中国国家发明专利9项（其中已授权4项），实用新型专利授权3项，英国国家发明专利1项，PCT国际专利2项。

科研思路分析

Q：这项研究最初目的是什么？或者说想法是如何产生的？

A：我们的目的很简单，就是想如何帮助临床医生更快速的判断微生物对药物的敏感性结果。如果我们能把患者标本的微生物检验时间由三天缩短到半天，不但可以减少甚至杜绝经验性用药带来的抗生素滥用，而且可以更快的治愈患者。单细胞拉曼与重水标记用于纯培养菌株的耐药分析国内外有多个团队进行了初步验证，我们认为通过优化标本前处理技术、建立革兰氏阴阳菌单细胞拉曼数据库和机器学习算法、以及开展大数据量对比测试将可以突破该技术原理应用于真实临床标本的瓶颈。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：由于拉曼光谱信号较弱，分析通量低而本研究中的样本数量又异常庞大，因此如何在较短时间内获得质量有保障的实验数据成为一个重要的挑战。通过信号处理和算法的优化，获得高信噪比拉曼光谱数据，提高数据采集和分析的自动华水平，在这一过程中起到了重要的作用。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或者研究机构可以从该成果中获得帮助？

A：这项技术可以在临床检验科发挥重要的作用，大大缩短检验科出具药敏报告的时间。医院检验科室或者微生物诊断产品研发的相关企业都可能从中获得启发或帮助。