数字式DNA Walker用于microRNA的精确定量分析

近年来，以微/纳颗粒为载体构建的3D DNA Walker等体系在多种生物标志物的荧光传感和成像分析中得到了广泛应用。传统DNA walker体系多是建立在金纳米颗粒上，由底物探针、行走臂和驱动力等组件所构成。通常，当体系中存在靶标分子时，金纳米颗粒等载体上特定的DNA结构可以在酶切催化或链置换反应等驱动力下，沿着特定的轨道自主行走，连续水解颗粒表面的多个核酸底物探针，从而产生荧光信号的恢复。虽然此类DNA纳米机器应用广泛，但较难实现生物标志物的精准定量。一方面，传统的3D DNA Walker体系用于生物标志物分析需依赖于标准曲线的建立，在复杂样品中，易受到多种因素的影响，如行走臂的封闭不彻底、非特异性的底物探针裂解、复杂基质的干扰以及反应环境的变化等，这些因素易导致非特异性背景和信号波动，影响目标分子定量的准确性。另一方面，有限的行走速率和扩增效率同样会限制检测灵敏度的提升。

针对上述问题，陕西师范大学化学化工学院刘成辉教授（点击查看介绍）团队近期发展了一种基于点击化学核酸连接反应的数字式DNA Walker（ddWalker）新思路，用于microRNA的精确定量分析。与传统的3D DNA Walker体系相比，该ddWalker设计有如下优点：（1）行走臂是通过靶标分子介导的高效点击化学核酸连接的方式固定到纳米颗粒载体表面，而非依靠传统的预固定化/预封闭—靶标分子竞争性激活方式，从而确保了更高的特异性；（2）该设计中，当靶标分子拷贝数远低于颗粒载体数目时，连接产生的行走臂在颗粒表面的分布遵循泊松分布规律，因此单个microRNA分子将在单个纳米颗粒表面引入一个行走臂。基于高度局域化的内切酶驱动，行走臂walking引发的底物探针依次裂解将被严格限制在该颗粒表面，不会发生跨颗粒间的切割反应。因此单分子行走臂在单个纳米颗粒表面的高度限域化运动将产生足够多的荧光分子，使得该纳米颗粒荧光信号能够被全内反射荧光显微镜检测到并统计为阳性颗粒，而不负载microRNA连接产物的纳米颗粒不会产生荧光信号。基于“一个microRNA分子→一个连接产物→一个阳性颗粒”的传导机制，通过统计阳性纳米颗粒的数量并结合泊松分布规律，可实现不依赖校准曲线的microRNA精确定量分析；（3）与传统的模拟信号输出模式相比，ddWalker的二进制数字式信号读出模式可以有效消除影响检测精度的多种因素，如背景荧光信号，不同颗粒上切割效率不同导致的波动，环境变化引起的信号随机波动等，使得检测结果更为精确。

图1. 基于单颗粒表面ddwalker策略的microRNA数字式检测原理图

图2. 方法特异性评估。（a）该ddWalker体系中，底物茎环探针的茎部修饰有荧光基团和猝灭基团，荧光信号被完全猝灭，所以底物探针不会引入背景荧光信号；（b）反应体系中游离的自由摆臂探针与底物环部杂交不稳定，不会被切刻内切酶识别并发生酶切反应，因此反应体系中自由摆臂探针的存在不会产生非特异性信号；（c）在该设计中，不存在靶标microRNA时，探针间不会发生非特异性的点击化学核酸连接反应，同样不会产生非特异性信号；（d）只有当摆臂探针通过microRNA介导的点击化学核酸连接反应固定到纳米颗粒载体表面时，由于高度临近效应，摆臂探针才可以与底物探针稳定杂交，切刻内切酶可以识别该杂交序列，并依次切割底物探针环部，实现单颗粒表面高度限域化ddWalker反应，观察到明亮的荧光阳性颗粒。

该ddWalker体系通过全内反射荧光显微镜计数荧光阳性纳米颗粒的数量，在遵循泊松分布的情况下，可以精确并数字化地反映初始microRNA的浓度，无需外部校准曲线，就可以对microRNA进行精确定量。同时，这种ddWalker设计具有很高的特异性，通用性，有望广泛应用于生物医学研究中。

图3. ddWalker纳米机器用于数字式microRNA检测的结果

这一研究成果近期发表在Analytical Chemistry 上，论文第一作者为陕西师范大学2017级博士研究生祁艳，刘成辉教授为该论文的通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Click Chemistry-Actuated Digital DNA Walker Confined on a Single Particle toward Absolute MicroRNA Quantification

Yan Qi, Yuqing Zhai, Wenjiao Fan, Wei Ren, Zhengping Li, Chenghui Liu*

Anal. Chem., 2021, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c04073

导师介绍

刘成辉

https://www.x-mol.com/university/faculty/12383