赵明磊/刘磊团队揭示p97/Npl4跷跷板工作构象及双硫仑衍生物对此的抑制机制

p97 作为AAA+蛋白家族的一员，利用ATP水解产生的能量从各种大分子复合物中分离、去折叠蛋白质，是细胞稳态调控的核心分子机器 ^[1]。人体内现已发现30余种p97突变体与神经退行性疾病密切相关，靶向p97干扰蛋白稳态也是一种抗癌策略 ^[2]。p97行使功能的一大特点是结合多样的cofactors，参与不同的信号通路。其中最熟知的cofactor是Npl4/Ufd1组成的异源二聚体，参与内质网蛋白降解、分离底物以便蛋白酶体降解等等。

2017年12月，Nature 杂志发表了哥本哈根丹麦癌症协会研究中心的吉里•巴尔泰克(Jiri Bartek)的研究论文 ^[3]，首次明确了古老的戒酒药双硫仑的广谱抗癌作用机制，是双硫仑在体内的代谢产物和铜生成的配合物（CuET）能发挥抗癌活性。CuET通过靶向Npl4阻止细胞处理废弃蛋白，从而杀死癌细胞，这一发现解答了为什么接受过双硫仑戒酒治疗的病人癌症死亡率低于未服用双硫仑的病人，以及为何铜补剂能显著增强抑癌效果这令人百思不得其解的临床现象。

尽管人源p97/Npl4/Ufd1复合物如此重要，但是其行使功能的结构基础，以及CuET特异性靶向Npl4抑制细胞蛋白降解的分子基础至今未知。近日，清华大学化学系刘磊教授和美国芝加哥大学赵明磊助理教授团队在Nature Communications 杂志在线发表论文，报道了人源p97/Npl4/Ufd1复合体在招募有和没有底物状态的冷冻电镜复合物结构，发现人源Npl4在有无底物结合的情况下均以两个锌指通过类似跷跷板的模型结合人源p97，并且这种‘跷跷板’构象的切换对于p97的功能至关重要。

图1. Npl4结合p97的‘跷跷板’构象。图片来源：Nat. Commun.

此外，作者研究了特异性靶向Npl4的“抗癌神药”双硫仑衍生物CuET的抑制机理，发现CuET本身不具备抑制p97/Npl4/Ufd1复合物的功能，起到抑制作用的是其在氧化条件下释放的铜离子。基于一系列生化和电镜结构解析的结果，作者发现铜离子是通过氧化破坏Npl4的锌指结构域来“锁”住Npl4的跷跷板构象切换，从而抑制了p97功能。值得一提的是，作者的进一步研究指出CuET可能是作为载体运输铜离子跨越细胞膜到细胞内，在细胞内活性氧作用选择性释放铜离子。这一发现解释了为什么病人服用双硫仑多年，正常细胞却不受双硫仑的伤害，而肿瘤组织会被选择性广谱杀伤（因为CuET在活性氧含量较高的肿瘤组织中释放的铜离子量远高于活性氧含量较低的正常组织）。

图2. CuET选择性杀伤癌细胞机制图。图片来源：Nat. Commun.

文章的共同通讯作者为美国芝加哥大学赵明磊（Minglei Zhao）助理教授、清华大学化学系刘磊教授；芝加哥大学潘漫博士、清华大学生命学院2016级博士生郑清芸、芝加哥大学于圆圆博士为共同第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Seesaw conformations of Npl4 in the human p97 complex and the inhibitory mechanism of a disulfiram derivative

Man Pan, Qingyun Zheng, Yuanyuan Yu, Huasong Ai, Yuan Xie, Xin Zeng, Chu Wang, Lei Liu, Minglei Zhao

Nat. Commun., 2021, 12, 121, DOI: 10.1038/s41467-020-20359-x

参考文献：

1.Banerjee, S., Bartesaghi, A., Merk, A., Rao, P., Bulfer, S. L., Yan, Y., ... & Subramaniam, S. 2.3 Å resolution cryo-EM structure of human p97 and mechanism of allosteric inhibition. Science, 351, 871-875 (2016)..

2.Tang, W. K. & Xia, D. Mutations in the human AAA+ chaperone p97 and related diseases. Front. Mol. Biosci., 3, 79 (2016)

3.Skrott, Z. et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature, 552, 194 (2017)

作者简介

赵明磊教授课题组专注于解析生物大分子机器的功能机制及其在人类疾病中的作用，目前主要在研两种系统，p97/泛素化系统和Vault系统。p97是细胞蛋白质动态平衡的中心枢纽，它与多种神经退行性疾病有关，也是重要癌症药物的靶标。Major Vault Protein是包括人类在内的真核生物中最大的核糖核蛋白，是一类无膜细胞器，其功能至今仍然难以捉摸。课题组致力于使用X射线晶体学和低温电子显微镜技术解析这些蛋白质机器的功能状态，为这些分子机器功能调节分子设计提供结构基础。

课题组主页：https://zhaolab.uchicago.edu/

刘磊教授课题组致力于使用发展蛋白质合成化学技术制备传统生物学方法获取困难的蛋白质。通过发现蛋白酰肼连接反应，建立蛋白质化学合成新方法，不断提高合成白质的大小和复杂性。实现了修饰组蛋白、多聚泛素、核酸聚合酶等百余种蛋白质的化学合成，发展蛋白质药物与探索人工合成生命分子体系。

课题组主页：http://www.liulab-tsinghua.com/