Science：“海洋斗士”分子，对抗致命真菌感染

David R. Andes是美国威斯康星大学麦迪逊分校医学微生物及免疫系的一位教授。多年以来，他对致命性耐药真菌对全球人类健康带来的严重威胁深感忧虑。尤其是具有泛耐药性真菌耳念珠菌（Candida auris），它不仅传播迅速，而且对现有抗真菌药物（目前一线抗真菌药物也只有三类）都具有耐药性，一旦这类真菌进入医院或疗养院，病人感染率和死亡率都很高，堪称“杀手级”真菌。事实上，如何遏制耐药性真菌感染已经成为一个世界性医学难题。据统计，全球每年有近200万人死于真菌感染。

图1.David R. Andes教授。图片来源：威斯康星大学麦迪逊分校

因此，世界卫生组织（WHO）认为开发新型抗耐药真菌药物迫在眉睫。然而，在抗生素开发历史上举足轻重的土壤微生物资源已经辉煌不再，从中筛选的化合物结构重复率也越来越高。更为棘手的是，人类和真菌都是真核生物，在代谢路径上有一些相似性，使得很多抗真菌候选药物对人类存在毒副作用。这些现实困难导致数十年来这个领域进展缓慢，没有出现重量级研究成果。为了应对这些严峻挑战，David R. Andes 教授尝试从巨大的海洋微生物资源宝库中寻找有价值的先导化合物。为此，他和药学院同事、海洋天然产物专家Tim S. Bugni教授合作，前后用4年时间从佛罗里达群岛采集海洋无脊椎动物中的微生物，一共收集到1482株菌株。并从生活在海鞘体内的一种小单孢菌（Micromonospora）中发现了一种新型的抗真菌药物——Turbinmicin，它不仅能够有效地靶向致命的多重耐药真菌病原菌，而且还不会对小鼠模型产生毒副作用。相关成果发表在Science上。

图2. Tim S. Bugni 副教授。图片来源：威斯康星大学麦迪逊分校

他们利用液相色谱-质谱法（LC-MS），基于代谢组学、基因组学和细菌提取物代谢组抗菌活性阵列分析对收集到的菌株进行筛选。首先，他们通过层次聚类主成分分析（HCAPCA）和LC-MS代谢组学技术优化出174株化学多样性高的菌株。在主成分（PCA）评分图中，菌株WMMC-415从组群中被区分出来，显示存在化学多样性。他们再进行发酵，采用两步正交色谱法将分子分布在174个96孔板中，并通过高通量筛选评估了体外代谢组阵列抑制Candida albicans 的活性。结果，他们从共生于海洋生物E. turbinata 的小单孢菌Micromonospora sp. WMMC-415中发现了一种抗真菌药物，并将其命名为Turbinmicin（图3）。

图3. 利用多重耐药性药物筛选平台从海洋微生物中筛选出Turbinmicin。图片来源：Science

随后，他们对turbinmicin进行临床相关的体外抗真菌筛选和体内小鼠模型药效安全性评估。在体外抗菌谱分析中，他们测试了39株临床分离且包含各种耐药机制的病原菌，结果显示turbinmicin表现出极强的广谱抗耐药真菌活性。接着他们通过人类红细胞（RBC）溶血实验和小鼠模型最大耐受剂量（MTD）实验进行药物安全性评估，结果显示即使Turbinmicin浓度超过最小抑制率（MIC）1000倍时，依然未表现出红细胞溶血毒性，这表明该化合物具有较宽的治疗窗。在小鼠MTD模型中，他们注射turbinmicin剂量从1 mg/kg起以翻倍的方式增加，一直到256 mg/kg仍未发现小鼠有中毒迹象。他们继续评估了turbinmicin在嗜中性粒细胞小鼠感染耐药菌株C. auris (strain B11211)中的疗效。结果观察到turbinmicin在感染小鼠中存在剂量依赖性疗效，并且在给药浓度范围内未发现中毒迹象。此外，Turbinmicin 在这些小鼠模型中显示的抗真菌活性与其疗效高度相关。为了进一步评估临床效果，他们还评估了turbinmicin对高致死率的抗三唑真菌A. fumigatus的疗效。对于体内模型，他们选择中性粒细胞减少和皮质类固醇免疫抑制肺损伤小鼠模型，并通过定量聚合酶链式反应（PCR）进行分析。结果显示turbinmicin对A. fumigatus的剂量依赖性抑制作用与C. auris相似，并且所有的小鼠在turbinmicin治疗期内都表现健康（图4）。

图4. Turbinmicin 在体内外均显示出较强的抗多种多重耐药病原真菌疗效和哺乳动物安全性。图片来源：Science

为了破解turbinmicin逆天的抗耐药真菌机制，David R. Andes和Tim S. Bugni团队从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA-条形码敲除和敲降库着手。他们使用mRNA干扰（DAmP）敲降文库来降低必需基因的丰度，同时在非必需基因突变的诊断DNA-条形码敲降文库中评估turbinmicin 的效果。化学遗传学分析显示SEC14基因最引人注目。SEC14编码蛋白Sec14p 是一种trans-高尔基体网络的磷脂酰肌醇-磷脂酰胆碱转移蛋白。Sec14p是经过验证的真菌靶点，但迄今为止还从未有批准的抗真菌药物涉及此靶标。非必需敲除文库研究同样支持了Sec14p是turbinmicin 靶标的观点。接着，他们用Transpose NET 构建了一个遗传互作网络，这是一种使用诊断基因集稀疏数据输入网络节点的算法。结果显示SEC14 是该网络的一个“隐藏”中心节点。DAmP技术、诊断非必需遗传数据以及来自单倍剂量不足文库的C. albicans 突变体时间杀灭研究都支持Sec14p作为turbinmicin的主要靶点。另外，他们还直接通过酿酒酵母绿色荧光载运蛋白（GFP）Snc1分泌和内吞模型研究turbinmicin对膜运输的干扰作用。研究发现，在酿酒酵母指数增长期，GFP Snc1 在初生芽质膜中大量积累，并且更温和地定殖于高尔基体和内体膜中。然而，在turbinmicin 的存在下，GFP Snc1不再集中于芽内，而是只存在于高尔基体和内体。

图5. Turbinmicin的作用机制假说。图片来源：Science

总结

对于真菌药物研发而言，既要保持药物的安全性，又要避免真菌耐药性，成为横梗于药物研发专家面前的两座“大山”。即使是现有的棘白菌素、两性霉素和唑类抗真菌药物也无法圆满地解决上述问题。“海洋斗士”Turbinmicin的出现，无疑是近年来天然药物资源筛选出的“王炸”级别先导化合物，必然会引起学术界的高度关注和跟进研究，甚至极大地鼓舞了海洋天然产物研发阵营的士气。

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A marine microbiome antifungal targets urgent-threat drug-resistant fungi

Fan Zhang, Miao Zhao, Doug R. Braun, Spencer S. Ericksen, Jeff S. Piotrowski, Justin Nelson, Jian Peng, Gene E. Ananiev, Shaurya Chanana, Kenneth Barns, Jen Fossen, Hiram Sanchez, Marc G. Chevrette, Ilia A. Guzei, Changgui Zhao, Le Guo, Weiping Tang, Cameron R. Currie,

Scott R. Rajski, Anjon Audhya, David R. Andes, Tim S. Bugni

Science, 2020, 370, 974–978, DOI: 10.1126/science.abd6919

（本文由水村山郭供稿）