靶向PD-L1的非天然核酸适体的筛选与肿瘤免疫治疗的应用研究

肿瘤细胞可以利用免疫检查点蛋白之间的相互作用实现免疫逃逸，基于抑制免疫检查点阻断策略的肿瘤免疫疗法已取得了良好的临床效果，其中一条重要的免疫抑制性信号通路涉及到程序死亡蛋白-1（PD-1）与其配体PD-L1。目前，靶向该信号通路的常用免疫抑制剂是单克隆抗体，抗体类药物存在生产成本高、易引起免疫相关不良反应等问题。核酸适体是一类可化学合成、免疫原性低的亲和性分子，可以通过筛选的方式获得。但是，天然核酸易被生命体系中的核酸酶降解，限制了其在体内的功能。苏糖核酸 (threose nucleic acid, TNA) 是一种含非天然糖环的人工核酸。因其化学结构简单以及与天然核酸形成碱基配对的能力，TNA被认为可能是进化过程中RNA的前体。而且TNA具有优越的抗核酸酶降解能力，可被发展为高生物稳定性的功能核酸，应用于各类生物医学应用中。近日，南京大学于涵洋（点击查看介绍）课题组报道了靶向PD-L1蛋白的TNA适体及在肿瘤免疫治疗中的应用研究（图1）。

图1. TNA适配体抑制PD-1/PD-L1相互作用。（A）靶向PD-L1的TNA适配体抑制PD-1/PD-L1相互作用，应用于癌症免疫治疗。（B）TNA和RNA的化学结构单元。

作者使用毛细管分离技术，经过四轮筛选后，获得了多条可以结合人PD-L1蛋白的TNA适体，解离常数在100-1000 nM范围内。通过ELISA竞争结合实验评估其阻断效果，最优序列（S42和N5）抑制了超过50%的PD-1/PD-L1的相互作用，优于先前报道的一条DNA适体。进一步地，作者展示了TNA适体在细胞表面对PD-1/PD-L1相互作用的抑制效果。在加入了TNA适体后，高表达PD-1的细胞表面结合的PD-L1有所下降。证明了TNA适体可以阻断细胞表面的PD-1/PD-L1的相互作用。

图2. TNA适配体S42和N5抑制PD-1/PD-L1相互作用。（A）S42和N5的全长和截短形式的序列图。（B）ELISA竞争实验显示全长TNA适体抑制了50％以上的PD-1/PD-L1相互作用。（C）流式细胞仪分析的示意图。（D）S42和N5阻断了细胞表面上PD-1/PD-L1的相互作用。RFI：相对荧光强度。

为了测试TNA适体在小鼠体内对肿瘤细胞的靶向性，作者向移植了小鼠结肠癌CT26肿瘤模型的小鼠体内，通过尾静脉注射了荧光标记的TNA适体。结果表明，TNA适体可以特异性富集在肿瘤部位。作者最后对TNA适体的抑制肿瘤生长的能力进行评估，结果表明：使用TNA适体N5处理组的小鼠肿瘤生长受到了抑制，且没有出现小鼠体重下降等不良反应。结合细胞毒活性实验结果，表明TNA适体对肿瘤生长的抑制作用是因为阻断了PD-1/PD-L1的相互作用，从而激活了小鼠的先天性免疫反应，而不是因为TNA直接的细胞毒活性导致的（图3）。

图3. TNA适体在小鼠结肠癌肿瘤模型中富集并抑制肿瘤生长。（A）小鼠活体体表近红外荧光成像。（B）TNA适体N5在小鼠体内的组织器官上的分布。（C，D）TNA适体N5抑制肿瘤生长。（E）小鼠体重变化。（F）TNA适体N5的直接细胞毒活性测试。

综上所述，这项工作开发了结合PD-L1蛋白的非天然核酸适体，并研究了非天然核酸适体在肿瘤免疫治疗中的作用。这项工作中鉴定的TNA适体对靶蛋白的亲和力在纳摩尔每升范围，在蛋白水平和细胞表面都可以阻断PD-1/PD-L1的相互作用。在动物实验中，TNA适体可以在小鼠结肠癌肿瘤部位富集，并且对肿瘤生长具有显著的抑制作用。这项研究展示了非天然功能性核酸在肿瘤免疫治疗方面的应用潜力。

这一成果近期发表在Chemical Communications 上，南京大学博士研究生李欣彤为本文的第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Selection of threose nucleic acid aptamers to block PD-1/PD-L1 interaction for cancer immunotherapy

Xintong Li, Zhe Li, Hanyang Yu

Chem. Commun., 2020, 56, 14653-14656, DOI: 10.1039/D0CC06032A

导师介绍

于涵洋

https://www.x-mol.com/university/faculty/22066