北京化工大学-国家纳米科学中心Nat Mater：自组装构筑首例无辅因子的氧化模拟酶材料

副标题：北京化工大学王振刚教授与国家纳米科学中心王会副研究员和丁宝全研究员Nature Materials：聚组氨酸多肽自组装构筑无辅因子的氧化模拟酶纳米材料

天然的氧化还原酶（如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶等）主要依赖活性位点附近精确排布的氨基酸残基和辅因子（Cofactor）相互协作高效地催化底物的氧化还原反应，其中辅因子对于电子传递起着关键的作用。但是，在环境升温或pH波动时，随着蛋白质的解折叠，催化性残基的空间排布发生改变，导致辅因子的移位、脱落甚至聚集，使得酶不可逆地失活。基于酶催化原理和结构特点发展起来的超分子自组装，为酶的从头设计与构造提供了有效的途径。在前期的工作中，研究者通过生物分子自组装，构建了辅因子依赖性的类酶活性位点（Chem. Eur. J., 2019, 25, 12576; ACS Catal., 2018, 8, 7016; ACS Nano, 2017, 11, 7251）。对于辅因子依赖的氧化酶或模拟酶而言，是否能仅通过控制氨基酸基团的排列和协作，实现含有辅因子的活性位点的催化能力，仍是未知数。另一方面，具有复杂结构活性位点的酶在生命起源初始阶段的恶劣环境中，以何种分子组装形式实现催化功能，仍吸引广泛关注。

近日，北京化工大学王振刚课题组、国家纳米科学中心丁宝全课题组、施兴华课题组和清华大学刘冬生课题组合作，在仿酶催化领域取得新进展。研究成果以“Cofactor-free oxidase-mimetic nanomaterials from self-assembled histidine-rich peptides”为题在线发表于《自然•材料》（Nature Materials）杂志上。

血红素蛋白是一类以血红素（铁原卟啉）为辅因子的蛋白。在过氧化物酶、血红蛋白或一系列血红素模拟酶活性位点中，组氨酸残基作为配体或者酸、碱催化剂，能够显著提升血红素的催化活性。考虑到组氨酸侧链咪唑的氢键给体/供体功能和酸碱催化能力，研究者设计了不同长度、以COO^-和NH₃⁺为末端的聚组氨酸肽（最短为二肽），组装形成了可至数百微米乃至毫米级别的片状或者带状单晶晶体结构或无规的米粒结构；在不含有血红素辅因子或者金属时，表现出了催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺（TMB）等底物的活力或者H₂O₂歧化反应的活力。

图1. 示意图：a）辣根过氧化物酶（左侧）和抹香鲸肌红蛋白（右侧）活性中心结构；b）聚组氨酸多肽自组装过程；c）聚组氨酸多肽自组装结构催化模式。图片来源：Nat. Mater.

研究者系统地考察了自组装催化剂微结构和类过氧化物酶催化功能。在圆二色谱、X-射线粉末衍射和电子衍射高分辨电镜结果基础上，根据第一性原理计算发现，（0 1 0）晶面的氢键作用（源于β-sheet二级结构的主链）和静电作用（源于端基基团COO^-和NH₃⁺）、（1 0 0）、（0 0 1）晶面的π-π堆积和氢键作用（源于侧链咪唑）协同促进多肽链规整排列并形成单晶结构。晶体的形成决定了自组装材料的比催化活力（V_i per His），表明活力与组装能力的密切关系；进一步研究发现，聚组氨酸的组装能力和比催化活力关联着肽分子的浓度以及三种特征长度（二肽、十二肽、十五肽）：组氨酸单体没有表现出β-sheet结构信号以及催化活力；当长度超过2个残基时，分子开始组装，形成伸展的β-sheet结构并显示出催化活性；当长度超过12个残基时，分子链相互作用增强，使得比活力成指数级提高；当长度超过15个残基时，分子链无规卷曲，不利于链的有序排列，比活力显著下降。

图2. a）十五肽自组装结构的扫描电镜图（inset为带状结构）、电子衍射图和高分辨电镜图；b）十五肽自组装体的第一性原理计算结构模型；c）聚组氨酸肽的二级结构、活力与分子链长的定量关系。图片来源：Nat. Mater.

为了揭示催化机理，研究者分别使用酶促反应动力学和电子顺磁共振波谱（ERP）研究反应过程产生的中间体。酶促反应动力学实验表明，与血红素蛋白遵循的“乒乓”机理不同（底物和产物交替地与酶结合或从酶释放），无血红素的聚组氨酸组装体遵循“三元复合物”机理，即H₂O₂和TMB双底物以有序或无序的方式与催化剂结合形成三元复合物中间体。电子顺磁共振波谱（EPR）和自由基淬灭剂添加实验表明，在双底物与催化剂共存时生成超氧自由基•OOH，而仅存在双底物或者催化剂/TMB时无自由基信号产生。痕量金属或者I^-的影响通过ICP-MS、EDTA与金属/I^-的添加实验予以排除。结合分子对接和量子化学计算可以推论，自组装催化剂通过（0 1 0）晶面的组氨酸残基、以多重非共价相互作用吸附H₂O₂和TMB形成三元复合物，通过咪唑基与H₂O₂的氢转移、超氧自由基•OOH形成、超氧自由基与TMB和咪唑-H的氢转移，生成水和TMB阳离子自由基，最后回到初始态。需要指出的是，仅将催化剂与H₂O₂混合时，EPR谱显示出羟基自由基•OH信号，这对应于O-O键断裂以及催化剂对H₂O₂的催化分解反应。

聚组氨酸多肽催化剂的活性位点是组氨酸残基的周期性排列形成，在经历10次乃至数百次的加热/冷却或者酸化/中和循环处理后，活力没有任何损失，而且活力的响应性变化与组装结构的解离/重构对应，进一步证明了活力与多肽组装的关系；但是，含有血红素的天然酶或者模拟酶在经过十个循环处理后，活力均降低80%以上，这可能因为血红素与残基的脱离导致了活力的不可恢复。

图3. a）十五肽自组装体的催化动力学双倒数曲线；b）电子顺磁共振波谱；c）催化过程的理论模型；d）多肽催化剂（H15）与天然过氧化物酶（HRP）活力对热处理和酸处理的响应性。图片来源：Nat. Mater.

自组装催化材料的厚度（（0 0 1）和（1 0 0）晶面）为数纳米至微米级别，抑制了芳香性还原性底物（如TMB）与包埋在内部的组氨酸残基接触，降低了组氨酸的使用效率和表观TOF（turnover frequency）。为了提高催化剂的比表面积，将更多的组氨酸暴露于（0 1 0）晶面，研究者一方面通过超声处理降低组装结构尺寸，将TOF提高2~3.7倍；另一方面，将成纤多肽与聚组氨酸多肽共价偶连，引导聚组氨酸形成纤维状结构，提高催化剂的比表面积，能够将TOF提高一个数量级。在未来的工作，将结合理论模拟对催化剂组成和结构进行进一步优化，增强催化活力。

小结

该研究为氧化模拟酶催化剂的设计提供了新的策略，提出了新的氧化还原反应催化机制，拓宽了对生物催化的认知，也为简单的分子到具有复杂活性位点结构的辅因子依赖酶的化学演化过程提供了实验模型。

国家纳米科学中心的刘清博士和万铠玮（博士研究生）为该论文的共同第一作者，北京化工大学的王振刚教授、国家纳米科学中心的王会副研究员和丁宝全研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费、北京市科技计划、中科院战略性先导科技专项及前沿科学重点研究计划、科技部重点研发计划等项目的支持科学基金等项目的支持。

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Cofactor-free oxidase-mimetic nanomaterials from self-assembled histidine-rich peptides

Qing Liu, Kaiwei Wan, Yingxu Shang, Zhen-Gang Wang, Yiyang Zhang, Luru Dai, Chen Wang, Hui Wang, Xinghua Shi, Dongsheng Liu, Baoquan Ding

Nat. Mater., 2020, DOI: 10.1038/s41563-020-00856-6