Angew. Chem.：底物结合口袋的镜像分析——设计构建立体偏好性互补酶催化剂的有效策略

注：文末有本文科研思路分析

腈水解酶催化3-取代戊二腈的去对称化水解是合成镇痛药普瑞巴林、骨骼肌松弛剂巴氯芬等γ-氨基丁酸类药物的有效方法，但该酶对于3-烷基或3-芳基戊二腈底物，通常生成（S）-构型产物，而（R）-构型产物的对映体过量值较低。在不损失酶活的基础上利用定向进化技术构建立体选择性互补的酶催化剂仍然是一大挑战。自然界中存在一些立体选择性互补的酶，其活性口袋具有某种程度镜面对称性，这提示人们，通过对口袋内关键位点的分析及置换可能实现其立体偏好性的翻转，从而快速获得立体选择性互补的酶催化剂。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明研究员、吴洽庆研究员与林建平研究员带领的研究团队通过对来源于Synechocystis sp. PCC6803的腈水解酶（SsNIT）底物结合口袋的镜像分析，发现处于互为镜像位置的两个影响立体选择性的关键氨基酸残基W170与V198，而且其体积差别较大。将这两个氨基酸残基的位置进行互换，实现了该酶对3-异丁基戊二腈水解反应立体偏好性的翻转。

图1. 利用“镜像”策略改造腈水解酶立体偏好性

进一步采用蛋白质定向进化技术，作者重塑了该酶的底物结合口袋，获得了一系列的突变体，发现其对3-烷基及3-芳基取代的戊二腈均实现了立体选择性的翻转，尤其对烷基取代的底物显示了很高的立体选择性；其中突变体E8最为突出，酶催化活性大幅提高、立体选择性优良（>99% ee）。突变体E8可高效催化400 mM 3-异丁基戊二腈选择性水解，生成(R)-3-异丁基-4-氰基丁酸，分离产率97%，产物ee值大于99%；结合化学方法成功合成了(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸。

图2. 腈水解酶SsNIT立体偏好性的翻转及活性提升

动力学模拟结果显示，突变体E8催化活性大幅提高的原因在于大幅降低其催化三联体与3-异丁基戊二腈的结合能。本研究为腈水解酶及其它酶催化对称性化合物去对称化反应的立体选择性改造获得立体偏好性互补的酶催化剂提供了一种新的策略，也成功建立了(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸（普瑞巴林）的化学-酶法合成方法。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是中科院天津工业生物所的助理研究员于珊珊及李金龙、副研究员姚培圆。

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Inverting the enantiopreference of nitrilase‐catalyzed desymmetric hydrolysis of prochiral dinitriles by reshaping the binding pocket with a “mirror‐image” strategy

Shanshan Yu, Jinlong Li, Peiyuan Yao, Jinhui Feng, Yunfeng Cui, Jianjiong Li, Xiangtao Liu, Qiaqing Wu, Jianping Lin, Dunming Zhu

Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202012243

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：手性γ-氨基丁酸类化合物是合成许多药物的关键结构单元，而手性3-取代氰基羧酸是合成这类化合物的重要中间体。前期我们通过对腈水解酶的筛选及改造，高效、高立体选择性获得（S）-3-取代氰基羧酸（Sci. China Chem., 2014, 57, 1164-1171; Catal. Sci. Technol., 2019, 9, 1504-1510.），然后经过Curtius重排与水解可以得到相应（S）-普瑞巴林与（R）-巴氯芬，但是Curtius重排需要使用叠氮化合物，具有很大的安全隐患。然而，若能获得(R)-3-取代氰基羧酸，则可以通过水合反应与Hofmann重排生成（S）-普瑞巴林与（R）-巴氯芬，该过程无论从原子经济性还是安全性都有很大的优势。但是现有的腈水解酶催化3-烷基或芳基取代戊二腈水解主要生成（S）-构型产物，而（R）-构型产物的对映体过量值较低。前期通过酶的筛选及常规的蛋白改造策略未获得理想的突变体，因此，我们根据底物的结构特点对酶结合口袋进行镜像分析，发现了突变的关键氨基酸位点。基于我们前期的积累及随后的进一步蛋白改造，最终获得高活性、高选择性的突变体。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：本项研究最大的挑战就是缺少腈水解酶及其小分子复合物的晶体结构，缺少可借鉴指导的蛋白结构信息，以及缺少高通量筛选方法。我们采用传统的定向进化方法虽然也实现了产物构型的翻转，但产物ee值最高只能达到50%。自然界中存在立体选择性互补的酶催化剂，特别是脂肪酶的底物结合口袋的镜像分析研究，给了我们很大的启示。

此外，这项研究属于交叉学科的研究，其中需要化学、蛋白质工程及生物信息学方面的背景知识，需要多学科研究人员的通力合作。 

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：自然界中已知的酶不能满足人们对于特定构型的高立体选择性产物的需求，该研究成果为酶催化对称性化合物去对称化反应的立体选择性改造获得立体偏好性互补的酶催化剂提供了一种新的策略和方法。我们团队已构建了多种高效、高立体选择性的酶催化剂，可应用于相关精细化工行业的产品生成，为企业创造价值。