用于评估Hg2+引起的氧化应激“dual-key-and-lock”策略近红外荧光探针

汞 (Hg) 是一种剧毒的重金属，是威胁对人体健康的重要因素。通过食物链转移并在人身体沉积，然后引起慢性中毒，导致肝、肾、脑、胃和神经损伤。研究发现Hg²⁺可与含有巯基（SH）的物质结合，这导致含有巯基蛋白质、酶和脂质团聚。导致NO和O₂^•-爆发，迅速反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO^-）。然而，由于ONOO^-的氧化寿命短，活性高和水平低，其由Hg²⁺引起的氧化应激引起的ONOO^-含量的异常变化仍然不清楚。因此，开发有效的方法和技术来监测Hg²⁺引起的氧化应激将有助于深入了解Hg²⁺引起的疾病的生物学作用。

近日，郑州大学叶勇教授和河南省农业科学院张迪副研究员报道了首例同时响应Hg²⁺和 ONOO^-的近红外荧光探针NIR-HO，实现了Hg²⁺引起的氧化应激成像。NIR-HO是一种基于“dual-key-and-lock”策略和ICT机理的新型近红外发射荧光探针。如图1所示，传统的荧光探针只对单一目标分析物具有识别功能，同时针对Hg²⁺和ONOO^-响应的探针仍然未见报道。作者报道的该探针NIR-HO的硫代膦酸酯的P═S先被Hg²⁺氧化为P═O，然后ONOO^-具有较强的亲核性，会促进NIR-Hg中膦酸酯P–O键的裂解产生NIR-ONOO，ICT过程恢复并产生较强的近红外荧光发射。而单独加入Hg²⁺或者ONOO^-并不会引起荧光变化。该探针使得在活细胞中Hg²⁺引起的氧化应激成像成为可能。

图1. 探针NIR-HO设计与识别机理

作者首先在PBS (H₂O/EtOH = 4/6, v/v) pH 7.4缓冲溶液中（如图2所示），对NIR-HO对Hg²⁺和ONOO^-光谱反应进行了的研究。NIR-HO同时与Hg²⁺和ONOO^-反应，在680 nm处出现荧光发射，紫外可见吸收光谱在440和550 nm出现新的吸收峰。在Hg²⁺存在下，探针NIR-HO可在5 min内实现对ONOO^-的响应，检测限计算为24.0 nM，具有较高的灵敏度。这些结果表明，探针NIR-HO可以特异性检测Hg²⁺和ONOO^-。

图2. 探针NIR-HO的光谱性能测试

为了研究探针NIR-HO在细胞中是否对Hg²⁺和ONOO^-具有特异性的响应。如图3所示，作者通过细胞成像发现单独探针在细胞中是没有荧光发射，当细胞孵育Hg²⁺或者ONOO^-同样是不会引起荧光变化。以及同时孵育LPS和IFN-γ诱导内源性ONOO^-的产生，也不会引起荧光变化。然而，细胞在同时孵育Hg²⁺和ONOO^-会产生明显的荧光增强。表明探针在细胞中可以特异性的针对Hg²⁺和ONOO^-同时存在下进行成像。

图3. 探针NIR-HO对 Hg²⁺和ONOO^-细胞成像进行研究。

作者进一步通过NIR-OH和不同浓度Hg²⁺处理后细胞ONOO^-浓度的变化进一步评估了探针对细胞Hg²⁺引起的氧化应激的成像能力。如图4所示，随着Hg²⁺浓度升高，细胞内氧化应激产生了使ONOO^-水平升高。探针NIR-OH通过细胞成像可以针对汞离子中毒的程度进行有效地评估。

图4. 探针NIR-HO对 Hg²⁺诱导的氧化应激成像。

降低Hg²⁺引起的毒性是目前研究的一个热点领域，作者使用NAC、GSH和EDTA作为汞中毒的解毒药物。NAC、GSH可以有效的降低细胞中的活性氧水平，以及EDTA与Hg²⁺络合，达到清除Hg²⁺的目的。细胞成像结果表明加入这三种解毒药物以后，细胞中荧光强度显著降低，为研究Hg²⁺的解毒药物提供了一种有效的方法。

图5. 降低汞中毒的潜在药物评估研究。

作者为了研究探针NIR-HO的活体应用潜力，经过腹腔注射单独探针在小鼠体内基本没有荧光的，但是在注射Hg²⁺和ONOO^-后，出现明显的荧光变化，表明探针具有良好的生物应用价值。

图6. 探针NIR-HO在活体中成像研究。

总结

作者报道了一种新型的具有“dual-key-and-lock”策略和Hg²⁺激活型近红外发射荧光探针NIR-HO检测ONOO^-。NIR-HO探针检测细胞中的Hg²⁺和ONOO^-显示出优异的特异性和灵敏度。此外，首次验证Hg²⁺破坏人体的抗氧化防御系统功能，导致ONOO^-水平异常增加。因此，氧化应激可能是汞诱导毒性的主要致病机理。更重要的是，发现NAC，GSH和EDTA可被用作Hg²⁺诱导的毒性的良好的解毒药物。该新探针可能为检测Hg²⁺引起的氧化应激和研究排毒药物的开发提供有效的方法，另外，探针的设计策略为多识别探针提供一种新的设计思路。

相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者杨晓朋博士，通讯作者是叶勇教授和张迪副研究员。该工作得到了国家自然科学基金委，河南省教育厅和河南省农业科学院等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Imaging Hg²⁺-Induced Oxidative Stress by NIR Molecular Probe with “Dual-Key-and-Lock” Strategy

Xiaopeng Yang, Xiaojing Han, Yongru Zhang, Jianfei Liu, Jun Tang, Di Zhang*, Yufen Zhao, Yong Ye*

Anal. Chem., 2020, 92, 12002–12009, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02509

导师介绍

叶勇教授，教育部新世纪优秀人才，河南省学术技术带头人，省青年骨干教师，河南省磷化工工程技术中心副主任，有机化学学科骨干。1995年毕业于天津南开大学化学系，2000年南开大学元素所硕士毕业并获理学硕士学位，2003年南开大学元素所（国家重点实验室）毕业并获理学博士学位，同年到清华大学化学系生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室做博士后。2005年6月,到郑州大学工作。目前主要从事生物相关活性分子荧光探针设计与应用、阻燃剂和有机磷化学研究。

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