Nature Catalysis：季泉江/甘建华揭示嗜热链球菌Cas9核酸酶催化机制并进化拓展其可编辑位点

CRISPR/Cas9基因组编辑技术由于简便性和高效性，已经被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前最广泛使用的酿脓链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9），由于脱靶性、细胞毒性、大尺寸（1368个氨基酸）和严格的PAM识别等性质严重限制了其在疾病治疗等领域的应用。发掘和改造来自不同物种中的Cas9核酸酶是解决目前CRISPR/Cas9技术问题的一种行之有效的方法。嗜热链球菌St1Cas9是最早发现的Cas9核酸酶之一，具有尺寸小（1121个氨基酸，适用于单个AAV载体组装）、脱靶率低、低细胞毒性等优点，并且近年来报道了其在哺乳动物细胞中具有较高的基因编辑活性，具有潜在的临床应用价值，然而其严格的PAM识别特性限制了其可编辑的位点。

近日，上海科技大学季泉江（点击查看介绍）课题组与复旦大学甘建华（点击查看介绍）课题组合作在Nature Catalysis发表研究论文，解析了Cas9核酸酶罕见的催化状态结构，揭示了嗜热链球菌Cas9核酸酶（Streptococcus thermophilus Cas9，St1Cas9）的催化机制和PAM DNA识别机制，并基于这些机制进化拓展了St1Cas9 PAM DNA识别，为Cas9核酸酶工作机制的理解和定向进化奠定了重要基础。

图1. HNH核酸酶结构域催化状态结构

St1Cas9不同于其它Cas9核酸酶的生物化学性质暗示其不同的DNA识别和催化机制。为了阐明St1Cas9的工作机制，研究人员成功解析了St1Cas9-sgRNA-DNA的三元复合物晶体结构，并且意外发现其中的Cas9核酸酶处于DNA切割的催化活性状态，清晰揭示了HNH核酸酶结构域切割DNA靶向链的分子机制（图1）。Cas9的HNH核酸酶结构域具有较高的柔性，因而在目前解析的Cas9复合物结构中，HNH核酸酶结构域大多处于非活性状态。进一步分析发现，St1Cas9具有独一无二的“wing”区域。wing区域主要由两个β折叠组成，通过氢键、盐桥以及范德华力将HNH核酸酶结构域稳定在活性状态，起到调控St1Cas9切割活性以及脱靶活性的作用（图2）。

图2. wing区域的性质与功能

该研究同时揭示了St1Cas9识别不同PAM DNA的分子机制。不同于目前已有的Cas9家族的PAM识别机制，St1Cas9同时运用氢键和范德华力来识别较为复杂的NNAGAA PAM DNA （N为任意碱基），丰富了Cas9家族PAM识别机制（图3）。为了拓展St1Cas9 PAM DNA识别，研究人员依据其分子机制进行定向进化，通过引入D939K/E1057L/N1081K/K1086L这四种氨基酸突变，构建了St1Cas9的KLKL变体，消除St1Cas9对PAM DNA第四号位碱基特异性的相互作用并补以非碱基特异性的相互作用，成功地将St1Cas9的PAM识别范围从野生型的NNAGAA拓展为NNRNAA（N为任意碱基，R为A或G碱基），扩大了St1Cas9的基因编辑范围，具有更为广阔的应用前景（图4）。

图3. PAM DNA识别机制

图4. St1Cas9定向进化

季泉江课题组博士研究生张翼飞和张洪源分别为论文第一、第二作者，季泉江教授和复旦大学甘建华教授为论文共同通讯作者，上海科技大学iHuman研究所赵素文教授和博士研究生许雪霞参与了此项研究，上海科技大学生命学院黄行许教授为该研究提供了宝贵意见。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Catalytic-state structure and engineering of Streptococcus thermophilus Cas9

Yifei Zhang, Hongyuan Zhang, Xuexia Xu, Yujue Wang, Weizhong Chen, Yannan Wang, Zhaowei Wu, Na Tang, Yu Wang, Suwen Zhao, Jianhua Gan, Quanjiang Ji

Nat. Catal., 2020, DOI: 10.1038/s41929-020-00506-9

导师介绍

季泉江

https://www.x-mol.com/university/faculty/21447

甘建华

https://www.x-mol.com/university/faculty/240675