三萜化合物是一大类活性天然产物,具有重要的药理活性,是天然药物的重要来源。同时,三萜对植物而言具有重要的生理意义,如水稻花粉萌发、植物激素等;也是植物的“生化武器”,具有抗病、抗虫,抵抗环境胁迫等生物学功能。
2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-oxidosqualene cyclase, OSC)是三萜化合物生物合成的关键酶,将柔性的线性底物精准地催化环化生成100多种不同骨架结构的三萜产物,被视为最复杂的生化反应之一,其催化机制吸引生物化学家数十年的兴趣。近日,广州中医药大学的段礼新教授和中山大学巫瑞波教授共同发现了鸢尾植物中具有独特催化功能域的三萜环化酶(ItOSC2和ItOSC6),并解析它们的催化机制,为深入理解三萜生物合成机制、三萜环化酶序列多样性与产物多样性的关系,和三萜环化酶的蛋白质工程研究奠定一定的基础。
图1. 不同类型的三萜环化酶及关键催化位点
作者从传统中药药用植物鸢尾(Iris tectorum Maxim)中克隆并鉴定了3个三萜环化酶ItOSC2、ItOSC3和ItOSC6,ItOSC2是主要产生α-香树素(α-Amyrin),ItOSC6产生羽扇豆醇(Lupeol),ItOSC3合成环阿屯醇(Cycloartenol)。ItOSC2和ItOSC6它们具有独特的催化结构域(FLALA和LMVLA),以及一个不同寻常的芳香族酪氨酸残基Y531,它与普通C-C-C构型的(A/B/C环构型)OSC保守的的W531不同(图1)。通过比较500多种OSCs序列,发现该催化功能域具有较强的序列独特性。此外,目前自然界中α-Amyrin(>80%)合酶发现得较少,只有6例(不包括ItOSC2)。
为了解析ItOSC2和ItOSC6独特的催化机制,研究者采用了氨基酸定点突变和量子力学-分子力学组合(QM/MM)的多尺度模拟相结合的方法,证明了ItOSC2主要生成α-Amyrin的机制。从反应途径自由能计算(图2)结果,虽然生成Oleanyl cation中间体(β-Amyrin生成途径)释放更多的能量,然而,生成Ursanyl cation中间体(α-Amyrin生成途径)经历一个更低的能垒,从而使得反应产物主要生成α-Amyrin。
图2. QM/MM-MD模拟计算ItOSC2的反应自由能
进一步通过定点突变分析,揭示了ItOSC2和ItOSC6的关键催化氨基酸位点,普通OSCs在该催化结构域通过芳香氨基酸的cation-π相互作用,稳定反应过程中碳正离子的催化机制不同,ItOSC2和ItOSC6通过脂肪氨基酸残基体积的大小,恰到好处地控制着产物的比例。研究发现,ItOSC2存在一个在空间邻近的Y-LL,构成一个催化三体,负责C29-甲基的迁移和去质子化终止反应的过程。为了探讨该催化三体是否在于其它几种常见的OSCs上,作者比较了环阿屯醇合酶 (Cycloartenol synthase,CAS)、羽扇豆醇合酶(Lupeol synthase, LUS)、β-香树素合酶(bAS),发现他们都有相对保守的W-WY(bAS)或者Y-ML(ItOSC6),Y-WH(CAS)催化三体特征,分别控制着五环三萜(包括Cycloartenol)第五个环的形成和构型。与其它6种α-Amyrin合酶序列比较,发现大部分α-Amyrin合酶具有W-xY的特征(图3),而ItOSC2具有相对独特的结构和催化机制,该研究丰富了植物三萜生物合成的催化机理。
图3. 不同类型的OSCs具有保守的空间催化三体特征
这一成果近期发表在ACS Catalysis 上,由广州中医药大学硕士生吴世丹、中山大学博士张帆为论文的共同第一作者,美国Arizona University的Istvan Molnar教授也是论文的共同作者,中山大学巫瑞波教授、广州中医药大学刘中秋教授和段礼新教授为论为共同通讯作者。
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An Unexpected Oxidosqualene Cyclase Active Site Architecture in the Iris tectorum Multifunctional α-Amyrin Synthase
Shidan Wu, Fan Zhang, Wenbo Xiong, Istvan Molnar, jincai liang, Ai-jia Ji, Yu Li, CAIXIA WANG, Shengliang Wang, Zhongqiu Liu, Ruibo Wu, Lixin Duan
ACS Catal., 2020, DOI: 10.1021/acscatal.0c03231
段礼新博士简介
段礼新,广州中医药大学中药学院研究员,2002本科毕业于武汉大学药学院,2007年博士毕业于沈阳药科大学,2007-2017在中国科学院植物研究所工作,2015.3-2016.3在美国Arizona University访问学者,2017至今,广州中医药大学中药学院工作。
研究领域是药用植物萜类天然产物的生物合成研究,在Science,Nature Plants, Molecular Plant,Journal of the American Chemical Society等期刊发表相关研究论文。
研究组主页
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