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细胞内高精度的结构与动态信息获取:高稳定性高灵敏度自旋探针和EPR距离测量体系

在结构生物学飞速发展的今天,挑战在生理条件下观察生物大分子行使功能的微观操作,仍然极具吸引力。在冷冻电镜、单分子荧光共振能量转移和核磁共振等技术大展身手的蓝图里,看似“淳朴”的电子顺磁共振(EPR),凭借它对复杂环境背景“熟视无睹”和对自旋信号“明察秋毫”的特性始终保持着活力。若能充分挖掘它在生理环境中的实验潜力,有望实现蛋白质机器,特别是在细胞内,高精度结构信息的获取。


双电子自旋共振(double electron-electron resonance, DEER)技术,通过观测大分子内定点标记引入的两个顺磁中心之间的偶极作用,获得两者间的距离信息,正是应用最广泛的EPR距离测量方法。近年来,南开大学苏循成团队和以色列威兹曼科学研究院Daniella Goldfarb教授合作,从适应细胞内还原性环境的稀土金属离子钆入手,发展细胞内DEER测量方法并成功实现了超低温下细胞内蛋白质动态行为的研究[1-3]。而发展丰富其他适用于细胞内环境,具有高灵敏度、高细胞内稳定、高结构刚性,性特别是能够满足生理温度DEER实验需求的自旋标记探针,是进一步推进细胞内生物大分子结构和动力学DEER研究的关键。最近苏循成团队和天津医科大学刘阳平教授团队合作,对三苯甲基(trityl or TAM)自由基类探针应用于细胞内DEER实验的可能性进行了探索

图1. CT02-MA探针修饰的蛋白在W-波段常规DEER实验中的表现,以及它与另两种常用自旋探针(M-Prox和DO3A-(Gd))在同一蛋白突变体上提供的结构信息分辨率(c)和谱图信噪比(d)的比较。


研究者在前期工作的基础上[4],发展了新的 TAM类自旋标记探针CT02-MA,通过C-S键与蛋白分子内的半胱氨酸链接,这种链接方式是目前规避还原性环境影响的主流策略之一。研究者对CT02-MA定点标记的蛋白分子在W-波段常规DEER实验中的表现进行了分析。实验采用了有利于提高信号信噪比、缩短采集时间的Arbitrary Waveform Generatiors (AWG)技术,并对实验条件进行了优化。结果显示,CT02-MA探针在DEER实验中展现了良好的信号灵敏度和结构刚性,能够提供优质的谱图信噪比和高分辨率的结构信息(图1)。


在DEER的结构生物学研究中,配合使用不同特性自旋探针的差异化标记,能够提供更丰富的特异性结构信息,在研究构象变化时十分有效。目前已报道的“正交”DEER研究包括了氮氧自由基类、过度金属锰离子或铁离子类型自旋探针间的混合使用。有鉴于此,研究者开展了CT02-MA探针与金属钆离子配合进行DEER实验的尝试。通过优化差异选择性链接条件,成功实现了同一蛋白分子内部CT02-MA与金属钆离子两个自旋中心间的距离测量,且建立并优化了相应的实验测量体系,为这一“正交”体系后期在功能性研究中开展工作铺平了道路。该成果作为封面文章发表在2019年5月的PCCP 杂志上。

图2. CT02-MA与DO3A-(Gd)探针在W-波段“正交”DEER实验中的表现。


在上述基础上,研究者开展了CT02-MA修饰蛋白分子在人源HeLa细胞内的W-波段DEER实验研究。体外自旋标记的蛋白质分子通过电转导入细胞后,弥散分布在细胞质中。在培养数小时后,细胞样品被收集,并在超低温进行DEER实验。研究者发现,培养4-5小时的细胞样品仍能观察到明显的TAM信号,表明CT02-MA探针具有足够的细胞内稳定性,可用于相应时间内生物大分子的结构和动态观察。此外,研究者对CT02-MA探针在室温下的EPR性质和DEER实验可行性进行了探索。虽然结果表明还需进行更多优化,但结合早前TAM类分子的室温EPR研究成果与本课题已取得的进展,研究者认为利用该类探针的室温DEER实验有极大的推进价值。这一成果发表在国际期刊The Journal of Physical Chemistry Letters 上。

图3. CT02-MA探针修饰的蛋白质分子在W-波段细胞内DEER实验中的表现。


苏循成课题组一直从事生物大分子溶液核磁共振与电子顺磁共振的研究,通过发展功能有机小分子探针和蛋白质的定点标记化学方法并借助生物磁共振技术阐述生物大分子原位条件下的动态变化与作用机制。刘阳平课题组聚焦稳定(双)自由基研发及磁共振应用、氧化还原探针研发、活性氧可控产生及靶向传输等。Daniella Goldfarb课题组在EPR领域具有非常深厚的积累。三位教授均为通讯作者。该课题获得中以合作研究项目、国家自然科学基金等项目资助。


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DEER distance measurements on trityl/trityl and Gd(iii)/trityl labelled proteins

Angeliki Giannoulis, Yin Yang, Yan-Jun Gong, Xiaoli Tan, Akiva Feintuch, Raanan Carmieli, Thorsten Bahrenberg, Yangping Liu*, Xun-Cheng Su*, Daniella Goldfarb*

Phys. Chem. Chem. Phys., 2019, 21, 10217-10227, DOI: 10.1039/c8cp07249c


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In-Cell Trityl–Trityl Distance Measurements on Proteins

Yin Yang, Bin-Bin Pan, Xiaoli Tan, Feng Yang, Yangping Liu*, Xun-Cheng Su*, Daniella Goldfarb*

J. Phys. Chem. Lett., 2020, 11, 1141–1147, DOI: 10.1021/acs.jpclett.9b03208


导师介绍

刘阳平

https://www.x-mol.com/university/faculty/49773

苏循成

https://www.x-mol.com/groups/xunchengsu


参考文献:

[1] Y. Yang, F. Yang, Y.J. Gong, J. L. ChenL, D. Goldfarb, X. C. Su. A reactive, rigid Gd(III) labeling tag for in-cell EPR distance measurements in proteins. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2017, 56(11), 2914-2918.

[2] Y. Yang, F. Yang, Y. J. Gong, T. Bahrenberg, A. Feintuch, X. C. Su, D. Goldfarb. High Sensitivity In-Cell EPR Distance Measurements on Proteins using an Optimized Gd(III) Spin Label. J. Phys. Chem. Lett., 2018, 9(20), 6119-6123.

[3] Y. Yang, F. Yang, X. Y. Li, X. C. Su, D. Goldfarb. In-Cell EPR Distance Measurements on Ubiquitin Labeled with a Rigid PyMTA-Gd(III) Tag. J. Phys. Chem. B., 2019, 123(5),1050-1059.

[4] Y. Liu, F. A. Villamena, J. Sun, Y. Xu, I. Dhimitruka and J. L. Zweier. Synthesis and characterization of ester-derivatized tetrathiatriarylmethyl radicals as intracellular oxygen probes. J. Org. Chem., 2008, 73(4), 1490–1497


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