三维DNA步行器纳米探针用于阿尔茨海默病早期诊断

阿尔茨海默氏病（AD）是一种进行性发展的神经系统退行性疾病，是老年人最常见的痴呆症形式。目前尚无针对AD的特效药物，但早期诊断与治疗有利于减轻神经损伤、延缓疾病症进展。AD起病隐匿，认知测试、神经影像学检查等常用诊断方法不适用于AD的早期诊断。因此，迫切需要有效的早期评估手段用于AD的监测。β淀粉样蛋白（Aβ）是AD典型病理特征——老年斑（SP）的主要成分，也是AD早期诊断的特异性生物标志物。Aβ具有单体、寡聚体、纤维等多种形式，其中游离的Aβ寡聚体（AβO）的神经毒性最强。近年来，已经报道了一些检测Aβ的方法，但大多存在灵敏度低、操作过程复杂、无法区分出AβO或需要昂贵抗体靶向等问题。因此，需要开发一种高灵敏度、高选择性、高稳定性的新方法用于检测AβO，这对AD的早期诊断和治疗评估具有重要意义。

为了解决上述问题，徐州医科大学药学院高丰雷副教授（点击查看介绍）团队在Analytical Chemistry 上报道了一种靶向AβO的3D DNA Walker纳米探针，具有信号放大效应，不仅能够在体外定量检测AβO，还可以在细胞和活体水平获得AβO原位成像，从而为AD的早期诊断提供重要参考依据。探针中使用的金纳米粒子（AuNP）是最稳定的生物相容性纳米材料之一，具有高表面体积比和高DNA装载率。尤其是直径在10~100 nm范围内的AuNP，可作为DNA的载体保护其免遭核酸酶的降解，并能够自由进出细胞而无需转染。此外，探针中的适配体（Aptamer）具有特异性识别功能，其与传统抗体相比，拥有诸多突出优势，包括亲和力强、目标范围广、化学结构稳定、易于制备、安全经济等。

图1. 基于3D DNA Walker纳米探针的AβO超敏检测和细胞/活体原位成像的示意图

本研究设计一种了3D DNA Walker纳米探针，该探针是由AβO适配体、Zn²⁺特异性DNA酶（DNAzyme）行走链、荧光标记的底物链、AuNP组成。其中，适配体作为阻断链对DNAzyme进行封锁，底物链末端荧光因靠近AuNP而被猝灭。当存在靶标AβO时，封锁行走链的适配体与AβO特异性结合，行走链中的DNAzyme解除封锁后催化活性恢复，在Zn²⁺的辅助下开始切割底物链，释放出荧光标记的底物链片段，荧光因远离AuNP而得以恢复。随后，行走链中的DNAzyme会自动结合并切割下一个底物链，即在AuNP表面自主行走，产生大量荧光信号。该方法具有高灵敏度、高特异性和直观可视化的优点，避免使用昂贵且不稳定的抗体，选择适配体作为识别元件靶向AβO，整个过程无需外部添加燃料链或蛋白质酶，最终能够产生大量荧光DNA片段，实现信号扩增。

图2. 3D DNA Walker纳米探针的表征与稳定性

本研究使用的AuNP的直径约为13 nm，呈球形，分布均匀，没有明显的聚集。当DNA功能化AuNP形成3D DNA Walker纳米探针后，其直径仅增加至25 nm，尺寸较小，更易进入生物组织及细胞内。3D DNA Walker纳米探针具有良好的稳定性，在多种介质中能稳定存在，可用于检测不同环境中的AβO。

图3. 3D DNA Walker纳米探针定量检测AβO

3D DNA Walker纳米探针在AβO体外定量检测中，展现出优异的性能，其灵敏度高于已报道的许多检测方法，能够满足痕量AβO检测的需求。此外，测试AβO及各类相似干扰物或共存物质对纳米探针的响应，3D DNA Walker纳米探针表现出对AβO的高度特异性，这主要归因于纳米探针中适配体出色的靶向作用。

图4. 3D DNA Walker纳米探针原位成像细胞内AβO的可行性

本研究进一步阐明，3D DNA Walker纳米探针能够在活细胞中成功运行，产生信号放大效应，显微镜下可见鲜红色的荧光信号。因此，探针可以在细胞环境中对AβO进行准确定位并可视化其分布，动态监测其聚集变化。

图5. 3D DNA Walker纳米探针在小鼠脑部的荧光成像及组织学观察

3D DNA Walker纳米探针能够作为成像剂对活体内的AβO进行荧光成像，有效区分AD小鼠和正常小鼠，从而构建起活体成像的诊断平台。注射探针后的小鼠，其主要器官均未发现明显的组织病理学异常，证实3D DNA Walker纳米探针具有良好的生物安全性。

这一研究成果近期已发表在Analytical Chemistry 上，论文第一作者为徐州医科大学2017级硕士研究生尹一鸣，耿德勤教授为该论文的共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

DNAzyme-Powered Three-Dimensional DNA Walker Nanoprobe for Detection Amyloid β-Peptide Oligomer in Living Cells and in Vivo

Yiming Yin, Guofang Chen, Ling Gong, Kezhen Ge, Wenzhen Pan, Na Li, Jeremiah Ong’achwa Machuki, Yanyan Yu, Deqin Geng, Haifeng Dong, Fenglei Gao

Anal. Chem., 2020, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c01592

导师介绍

高丰雷

https://www.x-mol.com/university/faculty/97649