王初课题组发展新型探针大规模分析炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心王初（点击查看介绍）课题组在Journal of American Chemical Society杂志上发表论文，他们开发了新型衣康酸修饰探针工具，并结合定量化学蛋白质组学技术，首次实现了炎症巨噬细胞中衣康酸修饰半胱氨酸位点的大规模直接鉴定，并且进一步揭示了衣康酸对细胞程序性坏死过程的调节作用。

衣康酸是近些年来被发现具有显著抗炎抗菌活性的代谢物分子，它在病原菌侵染或者脂多糖刺激的炎症巨噬细胞中会大量产生，浓度可达到毫摩级别，并广泛参与到抗炎信号通路中。由于衣康酸具有共轭不饱和双键结构，它可以通过迈克尔加成反应共价修饰蛋白质中的半胱氨酸残基，通过影响底物蛋白的活性和功能从而调节炎症反应过程。例如衣康酸可以共价修饰并抑制keap1进而释放Nrf2调控抗炎抗氧化基因表达，还可以通过与GSH反应增加氧化压力，进而激活ATF3介导的炎症轴的调节等。因此衣康酸修饰蛋白的大规模鉴定对理解其炎症调节机理具有重要的意义，然而由于缺乏衣康酸修饰的抗体等原因，实现这一目标存在着很大的挑战。此前，王初课题组和陈兴课题组共同合作发展了新型半胱氨酸靶向非天然糖探针，并结合竞争性化学蛋白质组学技术首次在组学水平上对衣康酸的半胱氨酸修饰位点进行系统的分析，并成功发现了260个高置信度的衣康酸修饰位点。其中，衣康酸可以修饰和抑制糖酵解通路中关键蛋白ALDOA、LDHA和GAPDH，进行负反馈调节抵抗炎症。然而，该方法只能在细胞裂解液中进行，并且由于是一种基于竞争标记的方法，所以只能间接地检测衣康酸在半胱氨酸上的修饰。为了解决以上局限性，在本工作中，作者们发展了一种带有生物正交基团的新型衣康酸探针——ITalk，它可以有效的进入细胞中并实现活细胞内衣康酸修饰蛋白的直接捕捉，再结合定量蛋白质组学对衣康酸修饰蛋白和位点进行大规模分析和鉴定。

基于衣康酸类似物OI，作者设计合成了ITalk探针，并分别在小分子和细胞裂解液水平上对其反应性进行测试，证实Italk具有和衣康酸类似的半胱氨酸反应活性。更为重要的是，ITalk的探针标记可以被衣康酸有效地竞争，而不具有半胱氨酸反应活性的甲基琥珀酸则不具有该竞争效果。同时，ITalk表现出与衣康酸类似的抗炎活性，能够抑制糖酵解以及激活NRF2通路等生物学效应，这些结果表明ITalk可以有效地模拟衣康酸在巨噬细胞中的功能。

结合基于还原二甲基化标记的定量化学蛋白质组学技术，作者们利用Italk探针大规模鉴定了炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰蛋白，最终鉴定到1926个衣康酸修饰蛋白，不仅覆盖了绝大多数此前利用非天然糖探针鉴定到的衣康酸修饰蛋白，还极大地拓展了衣康酸修饰蛋白的数据库。另外，通过具有时间分辨度的化学蛋白质组学策略，作者们进一步从中成功筛选出了199个高反应活性的衣康酸修饰蛋白，这其中包括了此前已知的衣康酸功能性底物蛋白ALDOA和KEAP1等。

结合TOP-ABPP技术，作者们进一步对衣康酸修饰位点进行大规模直接鉴定，最终鉴定到属于862个蛋白的1164个半胱氨酸位点。这些修饰底物中包括了许多参与到炎症免疫响应和宿主防御相关调节通路中的关键蛋白，例如炎性小体、信号转导、转录和细胞死亡相关蛋白，暗示衣康酸可通过调节多种通路来影响巨噬细胞功能。作者们选取了几个新发现的修饰蛋白BRI3B、WIPI3和RIPK3并通过点突变实验对其修饰位点进行了验证。

作者们发现程序性坏死通路中的关键蛋白RIPK3的239、339、360三个半胱氨酸位点均可以被衣康酸修饰，而突变实验显示Cys360为主要修饰位点。更为重要的是，衣康酸在该位点的修饰能够促进RIPK3的232位丝氨酸上的磷酸化，并进而促进下游蛋白MLKL的磷酸化。当突变Cys360后，衣康酸则不能有效地诱导RIPK3磷酸化，证明衣康酸是通过修饰Cys360而促进RIPK3信号通路的激活和坏死。

总之，本工作首次报道了适用于活细胞标记的衣康酸生物正交探针，并实现了对炎症巨噬细胞中衣康酸修饰位点的直接鉴定。本研究为理解衣康酸在巨噬细胞炎症反应中的作用机制提供了丰富的数据支持，同时也揭示了衣康酸对RIPK3信号通路的潜在调节作用。本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心的王初教授，其指导的生命科学联合中心2014级博士毕业生秦为和2016级博士研究生张艳玲为本文的共同第一作者。王初课题组博士后唐欢、研究生刘东阳、博士毕业生陈影和博士后刘源等合作者为本课题做出了贡献。该工作受到科技部蛋白质重点专项、基金委国家杰出青年基金、重大研究计划培育项目等项目经费的支持。

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Chemoproteomic Profiling of Itaconation by Bioorthogonal Probes in Inflammatory Macrophages

Wei Qin, Yanling Zhang, Huan Tang, Dongyang Liu, Ying Chen, Yuan Liu, and Chu Wang*

J. Am. Chem. Soc., 2020, DOI: 10.1021/jacs.9b11962

导师介绍

王初

https://www.x-mol.com/university/faculty/8705