人工去RNA异戊烯基修饰酶

RNA的表观遗传修饰是RNA调节基因表达的化学基础，利用新反应技术和新分子工具对RNA修饰进行精准调控对揭示RNA介导的遗传信息表达网络具有重要意义。然而由于RNA本身的不稳定性，使得在活细胞水平进行化学调控变得十分困难。中国科学院化学研究所分子识别与功能院重点实验室程靓研究员（点击查看介绍）团队长期从事该领域的基础研究，提出了利用化学小分子和生物相容性化学反应对RNA修饰进行直接干预的新策略。在过去三年中，该课题组开发了一系列针对重要RNA表观遗传修饰的高选择、高灵敏、时空分辨的化学转化、荧光标记的原理和方法，分别报道了细胞水平的m⁶A RNA化学去甲基化（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 5028; Chem. Commun., 2017, 53, 10734）、m⁵C RNA的化学氧化（Adv. Synth. Catal., 2019, 361, 4685）以及f⁵C RNA的特异性标记等（Adv. Synth. Catal., 2019, 361, 5406）。

N⁶-异戊烯基腺苷（i⁶A）是一种存在于腺苷上的超修饰类型。在细菌和真核生物中，tRNA的37号位上的i⁶A修饰可以增强密码子和反密码子的相互作用，缺乏这种修饰将导致tRNA对它们的同源密码子的亲和力降低，并诱导线粒体相关的代谢紊乱。此外，游离的i⁶A核苷及其衍生物作为细胞分裂素的重要组成部分，广泛作用于植物生长发育的各个阶段，在高等植物的生长和分化，尤其是芽发育、愈伤组织中芽形成以及调节花发育和农作物产量方面发挥着重要作用。发展能够特异性地切断异戊烯基取代基的化学小分子，精确地调控内源性i⁶A的含量，对于阐明i⁶A RNA和i⁶A相关蛋白的生物学功能，研究依赖i⁶A的细胞途径，以及调控植物生长发育具有重要价值。然而由于N⁶-异戊烯基的活化极为困难，且与相应的N⁶-甲基修饰（m⁶A）区别较小，因此尚无特异性的化学调节工具。

在这项研究中，该研究团队设计合成了一系列在哌啶4-位取代的氧铵盐，通过对这些具有高氧化能力的化合物的深入研究，作者发现化合物2能够在温和的条件下特异性地对i⁶A碱基、核苷和i⁶A RNA进行去异戊烯基化。值得注意的是，哌啶氧铵盐也是有机合成中常见的氧化剂之一，它可将醇氧化为醛/酮等。但在对i⁶A的去异戊烯基的过程中，并没有发生2'、3'或5-羟基、碱基或核糖环的氧化。不仅如此，化合物2对正常核苷（A、U、C、G、dT）、其他常见的RNA修饰（m⁶A、ms²m⁶A、A_m、hm⁵C、f⁵C）、容易被氧化的氨基酸残基（Ser、Thr、Met）以及同样含有异戊烯基修饰的内源性天然产物（9-prenyladenine、欧前胡素Imperatorin）均无影响，表现出优秀的化学选择性和极好的生物相容性。

在此基础上，作者对这一类化合物的细胞活性和植物调控进行了研究。实验表明，哌啶氧铵盐2具有极低的细胞毒性，即便对细胞进行长达72小时的孵育，对细胞形态也无影响，而此时内源性i⁶A含量已经出现明显下降。此外，副产物2-OH对内源性i⁶A水平影响不大，这表明没有去异戊烯基能力的有机小分子不能直接干预内源性i⁶A。考虑到这种i⁶A的化学去异戊烯基的生物正交性，作者推测季铵盐2对i⁶A进行直接去异戊烯基化调控，而不是干扰其生物合成或代谢相关的酶。前人的研究表明，植物幼苗发育早期的细胞核和细胞分裂与i⁶A水平的变化有关，太高的含量，例如对植物种子进行i⁶A孵育时，对幼苗叶片和根的大小有负面影响。作者猜想，能否使用毒性较低的季铵盐2下调i⁶A的含量以产生相反的表型？为了验证这个假设，作者分别对拟南芥种子进行了单独的i⁶A和季铵盐2孵育处理。统计数据显示，与野生型（WT）相比，i⁶A处理组的幼苗的根长和叶片大小明显下降，这与之前的报道是一致的。有趣的是，利用哌啶氧铵盐2孵育的拟南芥种子发育明显加速，新生叶片生长速度更快，新生根系萌发更多。作者推测这些显著的表型差异可能与植物内i⁶A水平的变化有关，于是通过UPLC-MS/MS进一步量化了i⁶A及其各种结构衍生物的含量。结果表明，活体植株中的i⁶A及其代谢物的含量显著下降。

由此，作者实现了首个不通过干扰i⁶A的生化合成途径而是通过直接下调i⁶A的含量调节植物的生长的成功实例，不仅为i⁶A RNA修饰的生物学功能研究提供了重要的化学生物学工具，也为提高主要经济作物的育种效率和转化效益提供了重要的技术手段

上述研究成果发表在Angewandte Chemie International Edition。中国科学院化学研究所程靓研究员、河北大学罗都强教授和中国科学院上海植物生理生态研究所张天奇博士为本文的共同通讯作者，中国科学院化学研究所博士研究生程后平为第一作者。该研究得到国家自然科学基金委重大研究计划、科技部国家重点研发计划、中国科学院重点资助项目等的支持。

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Artificial Deprenylation of N⁶-isopentenyladenosine (i⁶A) RNA

Hou-Ping Cheng, Xiao-Hui Yang, Ling Lan, Li-Jun Xie, Chuan Chen, Cuimei Liu, Jinfang Chu, Zhi-Yan Li, Li Liu, Tian-Qi Zhang, Du-Qiang Luo, Liang Cheng

Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202003360

导师介绍

程靓

https://www.x-mol.com/university/faculty/66021