车祸现场与药物发现

故事发生在美国俄克拉荷马州的9号高速公路上。有一群人常常深夜在9号高速俄克拉荷马大学Norman附近路段巡弋，似乎在搜寻着什么。他们既不是交通事故搜救队，也不是公路维护保养人员，而是由俄克拉荷马大学Robert H. Cichewicz博士带领的研究团队。他们要寻找的，是这条路上因为交通事故意外身亡的小型野生哺乳动物。

原来，这条高速公路通过了州立野生动物保护区，时常有小型野生动物在横穿公路时不幸遇难。而苦于寻找哺乳动物内生微生物资源的Cichewicz博士，从这些小动物身体上看到了希望。

Robert H. Cichewicz博士（左）和他的研究生（右）。图片来源：ACS Cent. Sci. ^[1]

Cichewicz博士一直致力于研究真菌和细菌来源的药物先导化合物发现。大约10年前，他开始对从人体内外共生微生物体系中分离天然产物感兴趣，并预见到这个领域的研究会非常热门，当然也会竞争激烈。Cichewicz博士不愿意去“凑热闹”，他转而研究较冷门的来自非人类哺乳动物的微生物。然而，研究野生哺乳动物会面临很多困难，比如需要对动物进行诱捕并施以镇静剂，还要通过动物伦理协会的审批。

有没有既不主动伤害野生动物，又能规避动物伦理协会繁琐审批程序，还能完成研究计划的完美方法呢？这似乎有点天方夜谭。直到有一天，Cichewicz突然有了灵感，他想起了自己开车通过9号高速公路时，常常看到遇难小动物的遗体，它们就躺在那里，这不就是天赐的完美研究对象吗？

Cichewicz与俄克拉荷马大学的微生物学家Bradley S. Stevenson合作，带领整个团队开始了这一充满“机会主义”的研究工作。他们每天夜晚在高速公路上巡逻，记录下看到的各种野生动物交通事故，并尽量选择遇难8小时以内的动物遗体，以保证其接近活体状态。

取样时，他们将动物遗体转移到路边，用无菌棉签蘸取无菌缓冲液，从完整器官（嘴、鼻、耳、眼、直肠、胃肠道等）中刮取两份相同样品。其中一份涂抹在固体琼脂培养基上培养，挑取带有多样形态的代表性菌落，纯化成单菌落后，用质谱技术进行化学指纹分析，寻找有价值的菌落。同时，将菌落接种于含多种培养基的24孔板（每孔含一种培养基）中进行培养，抽取含菌培养液进行质谱分析，并用乙酸乙酯萃取菌液构建菌液天然产物组分库。他们将获得的组分进行抗菌活性测试，挑选抗菌活性和化学指纹数据好的菌落进行放大发酵，分离鉴定出其中的化合物。另一份样品运用相关基因组分析工具鉴定出天然产物生物合成基因簇。最后评估得到的化合物是否具有治疗效用及其微生物基因工程的前景。

从交通事故遇难哺乳动物中发现微生物天然产物的流程。图片来源：J. Nat. Prod. ^[2]

在整整两年的时间内，他们采样的遇难动物有臭鼬、犰狳、鹿、浣熊、松鼠和负鼠。其中以负鼠出现的频率最高，其所含菌株丰度也是最高的。他们通过天然产物组分库的生物活性测试筛选出一份来自负鼠耳朵的样品，这份样品能够抑制人类病原真菌——白色念珠菌（C. albicans）的生物膜形成。进一步研究发现，这份样品由两株细菌组成，分离鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和沙雷氏菌属（Serratia sp.）的菌株。

然而，他们在放大发酵假单胞菌（Pseudomonas sp.），分离纯化鉴定其主要代谢产物化合物1的时候遇到了一些小挫折。他们通过质谱分析，X射线单晶衍射（钼靶）和串联质谱MS/MS判定化合物1是粘液菌素（viscosin）。文章发表后，他们却发现化合物1的结构解析有误。X射线单晶衍射（铜靶）数据和化合物水解后的β-羟基脂肪酸比旋光度都支持化合物1结构是WLIP。为此，他们还对已发表的文章进行了正式的更正，以纠正化合物1的错误结构。

解析有误的结构viscosin 1（左）和更正后的正确结构WLIP（右）。图片来源：J. Nat. Prod. ^[2]

随后，他们分析了另一株沙雷氏菌（Serratia sp.）样品，分离鉴定出化合物2（serrawettin W2），并发现菌株中存在化合物2的微量同系物。于是他们进一步放大发酵沙雷氏菌，纯化出化合物3-5并鉴定结构，分别是serrawettin W4-6。他们通过生物合成相关知识，结合化合物水解后的β-羟基脂肪酸比旋光度的方法鉴定出化合物2-5的绝对构型。

化合物2-5（serrawettin W2、4、5、6）的结构。图片来源：J. Nat. Prod. ^[2]

他们对这株沙雷氏菌（Serratia sp.）的基因组进行测序分析，将分离鉴定出的天然产物与其潜在的生物合成基因簇相关联，一共鉴定出8个潜在的次级代谢产物合成基因簇，其中一个候选基因簇与构建化合物2-5所需的基因序列几乎完美匹配。

最后，他们评价了化合物对白色念珠菌生物膜形成的抑制活性，发现分离自假单胞菌的化合物1抑制能力最强，IC₅₀（半抑制浓度）值为4.6±1.0 μM，分离自沙雷氏菌的化合物2-5也表现出一定的抑制能力，其IC₅₀值分别为7.7 ± 0.7 μM、59.8 ± 5.7 μM、13.4 ± 0.2 μM和29.2 ± 0.4 μM。

Cichewicz博士希望他们的研究工作流程能够帮助他们自己和其他同行在未来发现更多的天然产物。尽管Cichewicz只对开发人用治疗药物感兴趣，但他也指出，这些微生物资源极有希望用于研究猪、羊等牲畜的潜在益生菌。

另一位合作者Stevenson笑谈这项研究已经成为他们晚餐中最有趣的话题。人们甚至联系他们，并热心地为他们提供野生动物交通事故线索。笔者也认为，这项研究取材“剑走偏锋”，体现了科学家的足智多谋。当然，从关爱生命的角度去想，今后有没有可能就如何保护小动物横穿高速公路的安全做一项课题研究呢？如果命丧车祸的小动物减少了，那机智的Cichewicz博士又会想出什么新的取材策略呢……

参考文献：

1. A Conversation with Robert Cichewicz, ACS Cent. Sci., 2020, 6, 6−7, DOI:10.1021/acscentsci.9b01332.

2. Opportunistic Sampling of Roadkill as an Entry Point to Accessing Natural Products Assembled by Bacteria Associated with Nonanthropoidal Mammalian Microbiomes. J. Nat. Prod., 2017, 80, 598-608, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.6b00772

（本文由水村山郭供稿）